組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）突變體乳腺特異性表達載體的構建及其細胞表達研究.pdf

1、組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator，t-PA)是治療血栓性疾病的重要藥物。自1980年首次證實t-PA具有高效特異性的溶栓作用以來，t-PA因其與纖維蛋白親和力高、引起全身出血傾向小、溶栓能力強等優(yōu)點而被廣泛用于各種血栓性疾病的治療。但是t-PA在血液中的半衰期甚短(3min～5min)，在臨床治療中必須大劑量靜脈滴注才能維持其有效濃度，增加了全身出血的危險。目前，臨床上用于血栓性疾

2、病治療的t-PA主要靠大規(guī)模培養(yǎng)哺乳動物細胞生產，存在生產成本高、產量小、濃度低等缺陷，致使t-PA價格昂貴臨床治療費用高。利用動物乳腺生物反應器來生產不僅維持生產的成本低，而且產量高還能進行翻譯后修飾和正確折疊。 本研究以山羊β-乳球蛋白基因調控區(qū)為指導元件，以人組織型纖溶酶原激活劑F、E、K1區(qū)及Asp 117糖基化位點缺失體為表達序列，構建了乳腺特異性表達載體pBCrt-PA，轉染山羊乳腺上皮細胞，篩選獲得穩(wěn)定表達細胞株

3、。應用PCR法以實驗室保存的野生型t-PA cDNA為模板擴增出長度約1.1kb含K2和P區(qū)的t-PA部分序列。同時，合成一段長度為60bp的山羊β-乳球蛋白信號肽編碼序列。利用定向克隆法，將山羊β-乳球蛋白信號肽編碼序列插入到克隆載體pCEP4中。然后，將已擴增的t-PA cDNA序列定向克隆到山羊β-乳球蛋白信號肽編碼序列之后。再將含有CMV、山羊β-乳球蛋白信號肽編碼序列、t-PA以及SV40p(A)序列的基因片段，克隆到實驗室已

4、有的通用乳腺特異性表達載體BnF95中，最終構建了由山羊β-乳球蛋白基因5'、3'調控序列指導的t-PA cDNA突變體乳腺特異性表達載體pBCrt-PA。 進一步用Sal I、Not I雙酶切pBCrt-PA回收大小約9.8kb的轉基因片段。通過電擊轉染法將轉基因片段導入體外培養(yǎng)的奶山羊乳腺上皮細胞。經G418篩選三周后得到62株抗G418的陽性細胞株。提取抗G418的陽性細胞株基因組DNA，經PCR檢測初步確認有22株細胞

5、中整合了外源基因。用催乳素對PCR檢測陽性細胞株進行誘導表達，收集誘導表達48h后細胞上清進行ELISA檢測。檢測結果表明，有2株PCR檢測陽性細胞株可表達t-PA突變體，但表達量相對較低，其表達水平分別為5.98ng/ml和2.35ng/ml。對于表達產物的活性、半衰期檢測以及如何提高表達水平有待進一步研究。 t-PA．突變體基因的克隆以及這種載體構建思路，為將來制備轉基因山羊乳腺生物反應器大量生產特異溶栓活性強、半衰期延長的新型溶栓