miRNA-451對RF-6A視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的生物學影響.pdf

1、研究目的：
　　探究miRNA-451對RF/6A視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及管腔形成能力等生物學特征的影響及其可能的機制，為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將 miRNA-451的類似物（mimic）和抑制劑（inhibitor）轉(zhuǎn)染進RF/6A細胞中，測定轉(zhuǎn)染效率。
　　2.將RF/6A細胞分為四個組：miRNA-451 mimic組、miRNA-451 m

2、imic control（類似物對照）組、miRNA-451 inhibitor組、miRNA-451 inhibitor control（抑制劑對照）組，利用CCK-8檢測細胞增殖能力，細胞劃痕實驗和Transwell遷移實驗檢測細胞遷移能力，Matrigel管腔形成實驗觀察細胞形成管腔的能力。RT-PCR檢測與生物學行為相關(guān)基因的表達情況。
　　3.以miRNA-451為研究對象，利用miRBase、miRanda、Targe

3、tScan、PicTar等數(shù)據(jù)庫對miRNA-451的作用靶點進行生物信息學分析，為實驗提供理論指導和依據(jù)。
　　4.利用SPSS19.0軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。組間的兩兩比較需要采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05則認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染效率檢測的結(jié)果顯示，6h后miRNA-451 mimic組在20uM時即有較高的轉(zhuǎn)染效率，miRNA-451 inhibi

4、tor組在80uM的轉(zhuǎn)染效率較高。
　　2.CCK-8細胞增殖實驗結(jié)果顯示：24h時，mimic組（1.049±0.020）較mimic control組（1.258±0.034）低，結(jié)果有統(tǒng)計學差異（F=0.413，P=0.000）。48h時mimic組（1.223±0.077）較mimic control組（1.400±0.037）低，結(jié)果具有統(tǒng)計學差異（F=2.401，P=0.002）。inhibitor組與inhibito

5、r control組相比較，24h時，兩組間無統(tǒng)計學差異（P>0.05），48h時，inhibitor組（1.748±0.023）較inhibitor control組（1.689±0.421）高，結(jié)果有統(tǒng)計學差異（F=1.407，P=0.000）。
　　3.劃痕實驗結(jié)果顯示：miRNA-451 mimic組與mimic control組在觀察的時間段內(nèi)無統(tǒng)計學差異。6h時miRNA-451 inhibitor組（0.106±0.

6、036）較inhibitor control組（0.239±0.030）低，結(jié)果有統(tǒng)計學差異（F=0.039，P=0.008），12h時miRNA-451 inhibitor組（0.248±0.045）較inhibitor control組（0.445±0.053）低，結(jié)果有統(tǒng)計學差異（F=0.227，P=0.008）。24h時無統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　　4. Transwell結(jié)果顯示：miRNA-451 mimic組與

7、mimic control組在觀察的時間段內(nèi)無統(tǒng)計學差異（P<0.05）。miRNA-451 inhibitor組（57.750±8.655）較inhibitor control組（103.000±9.618）低，結(jié)果有統(tǒng)計學差異（F=0.011，P=0.000）。
　　5. Matrigel管腔形成結(jié)果顯示：miRNA-451 mimic（60.667±8.7369）組較mimic control（16.000±6.000）組高

8、，結(jié)果有統(tǒng)計學差異（F=0.688，P=0.002）。miRNA-451 inhibitor組（24.667±3.786）較inhibitor control組（65.333±5.033）低，結(jié)果有統(tǒng)計學差異（F=0.163，P=0.000）。
　　6. RT-PCR結(jié)果顯示：（1）CyclinA1的表達，24h時mimic組（0.424±0.033）低于mimic control組，差異具有統(tǒng)計學意義（F=15.923，P=0.

9、000），inhibitor組（0.042±0.042）低于inhibitor-control組，具有統(tǒng)計學差異（F=14.899，P=0.000）；（2）CyclinD1的表達，24h時mimic組（0.744±0.105）低于mimic control組，結(jié)果具有統(tǒng)計學差異（F=5.088，P=0.014），inhibitor組同 inhibitor-control組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；（3）PDGFRα的表達，24h時

10、mimic組同mimic control組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），inhibitor組（1.762±0.285）高于inhibitor-control組，結(jié)果具有統(tǒng)計學差異（F=5.549，P=0.01）；（4）MMP2的表達在24h時， mimic組（0.535±0.084）低于mimic control組，差異具有統(tǒng)計學意義（F=11.495， P=0.001），inhibitor組（0.042±0.016）低于inhibi

11、tor-control組，具有統(tǒng)計學差異（F=8.910，P=0.000）。
　　7.生物信息學結(jié)果表明，miRNA-451主要參與調(diào)節(jié)細胞發(fā)育、負性調(diào)節(jié)細胞增生及多種酶活性等生物學過程（P<0.05），可能與轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路、表皮生長因子信號通路、Wnt信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路、趨化因子信號通路、脂肪酸代謝通路（P<0.05）等通路相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.通過脂

12、質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，miRNA-451 mimic和miRNA-451 inhibitor可以有效的上調(diào)或下調(diào) RF/6A血管內(nèi)皮細胞中 miRNA-451的表達。結(jié)果顯示抑制細胞中miRNA-451表達的結(jié)果更有意義。當細胞中miRNA-451的表達降低時，增殖行為所受影響不大，細胞遷移受到抑制，形成管腔的能力下降，提示利用miRNA-451治療PDR具有潛在的可能性。
　　2.在下調(diào)miRNA-451表達水平后，Cyclins、PDG