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文檔簡介
1、嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophile CT2)是一種最適生長溫度較高的極端微生物,其產(chǎn)生的纖維素酶在高溫下可以保持優(yōu)良的催化活性,此特性利于纖維素酶的工業(yè)應用。本研究以嗜熱毛殼菌為研究對象,通過RT-PCR擴增出編碼嗜熱毛殼菌外切纖維二糖水解酶CBH3及內(nèi)切葡聚糖酶 EG2成熟肽的基因,利用畢赤酵母誘導表達體系分別對這兩個蛋白進行了高效表達、純化及性質(zhì)研究;對外切纖維二糖水解酶CBH3進行同源建模,選定了5個氨基酸位
2、點并且分別進行了定點突變,利用畢赤酵母表達體系同樣對5個突變酶分別進行了高效表達、純化及性質(zhì)研究。
酵母工程菌WTCBH3表達的CBH3酶,其蛋白分子量大小約為47kDa,最適反應溫度為60℃,最適反應pH為5。該酶在70℃條件下保溫1h后,剩余酶活力仍有最高酶活的80%,具有良好的熱穩(wěn)定性。CBH3在50℃~60℃時,酶活力保持在最高酶活的90%以上,但當反應溫度高于65℃后,CBH3酶活力會隨著溫度的升高而迅速降低,當溫度
3、達到70℃時,剩余酶活力不足20%;酵母工程菌WTEG2表達的EG2酶,其蛋白分子量大小約為45kDa,最適反應溫度為55℃,最適反應pH為5,該酶在70℃條件下保溫1h后,剩余酶活力有70%。
外切纖維二糖水解酶Cel7B與CBH3的氨基酸序列相似度達到80.65%,且Cel7B的空間三維結構已通過X射線衍射技術了解清楚,Cel7B各項參數(shù)符合同源建模的模板標準。將CBH3與Cel7B進行同源建模后,選定了CBH3上5個與底
4、物結合相關的氨基酸位點為突變位點。通過定點突變的方法,將5個選定的氨基酸分別突變?yōu)楸彼岷螅M行酵母誘導表達、純化、收集蛋白,測定純化蛋白的酶學性質(zhì),期待篩選出CBH3結構域中底物結合區(qū)的關鍵氨基酸。
對純化的5個突變酶 CBH3-246Y、CBH3-250R、CBH3-261D、CBH3-337D、CBH3-391R進行活性測定,5個突變酶的最適溫度均為60℃,最適pH均為5。5個突變酶的酶活力與原酶CBH3相比都產(chǎn)生了不同
5、程度的降低,其中突變體CBH3-391R的酶活力降低了約60%;突變體CBH3-246Y、CBH3-261D、CBH3-337D的酶活力均降低了25%以上。在反應溫度為40℃時,除CBH3-250R外,其它四個突變酶活力均降低到最高酶活的30%以下。
根據(jù)實驗結果可以推斷出,CBH3氨基酸序列中第246位的酪氨酸、第261位的天冬氨酸、第337位的天冬氨酸、第391位的精氨酸都是CBH3催化反應過程中與底物結合相關的重要氨基酸
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