嗜熱毛殼菌第七家族纖維素酶基因的克隆、表達與定點突變.pdf

1、嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophile CT2）是一種最適生長溫度較高的極端微生物，其產(chǎn)生的纖維素酶在高溫下可以保持優(yōu)良的催化活性，此特性利于纖維素酶的工業(yè)應用。本研究以嗜熱毛殼菌為研究對象，通過RT-PCR擴增出編碼嗜熱毛殼菌外切纖維二糖水解酶CBH3及內(nèi)切葡聚糖酶 EG2成熟肽的基因，利用畢赤酵母誘導表達體系分別對這兩個蛋白進行了高效表達、純化及性質(zhì)研究；對外切纖維二糖水解酶CBH3進行同源建模，選定了5個氨基酸位

2、點并且分別進行了定點突變，利用畢赤酵母表達體系同樣對5個突變酶分別進行了高效表達、純化及性質(zhì)研究。
　　酵母工程菌WTCBH3表達的CBH3酶，其蛋白分子量大小約為47kDa，最適反應溫度為60℃，最適反應pH為5。該酶在70℃條件下保溫1h后，剩余酶活力仍有最高酶活的80％，具有良好的熱穩(wěn)定性。CBH3在50℃~60℃時，酶活力保持在最高酶活的90%以上，但當反應溫度高于65℃后，CBH3酶活力會隨著溫度的升高而迅速降低，當溫度

3、達到70℃時，剩余酶活力不足20%；酵母工程菌WTEG2表達的EG2酶，其蛋白分子量大小約為45kDa，最適反應溫度為55℃，最適反應pH為5，該酶在70℃條件下保溫1h后，剩余酶活力有70%。
　　外切纖維二糖水解酶Cel7B與CBH3的氨基酸序列相似度達到80.65%，且Cel7B的空間三維結構已通過X射線衍射技術了解清楚，Cel7B各項參數(shù)符合同源建模的模板標準。將CBH3與Cel7B進行同源建模后，選定了CBH3上5個與底

4、物結合相關的氨基酸位點為突變位點。通過定點突變的方法，將5個選定的氨基酸分別突變?yōu)楸彼岷螅M行酵母誘導表達、純化、收集蛋白，測定純化蛋白的酶學性質(zhì)，期待篩選出CBH3結構域中底物結合區(qū)的關鍵氨基酸。
　　對純化的5個突變酶 CBH3-246Y、CBH3-250R、CBH3-261D、CBH3-337D、CBH3-391R進行活性測定，5個突變酶的最適溫度均為60℃，最適pH均為5。5個突變酶的酶活力與原酶CBH3相比都產(chǎn)生了不同

5、程度的降低，其中突變體CBH3-391R的酶活力降低了約60%；突變體CBH3-246Y、CBH3-261D、CBH3-337D的酶活力均降低了25%以上。在反應溫度為40℃時，除CBH3-250R外，其它四個突變酶活力均降低到最高酶活的30%以下。
　　根據(jù)實驗結果可以推斷出，CBH3氨基酸序列中第246位的酪氨酸、第261位的天冬氨酸、第337位的天冬氨酸、第391位的精氨酸都是CBH3催化反應過程中與底物結合相關的重要氨基酸