堿性纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、酶基因克隆及在大腸桿菌中的表達研究.pdf

1、纖維素資源和纖維素酶是各國研究的熱點領(lǐng)域，其中細菌產(chǎn)的堿性纖維素酶是研究的一個重要方面，堿性纖維素酶在洗滌、紡織、造紙、環(huán)保等行業(yè)都具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本文從堿性土樣中，篩選獲得20余株堿性纖維素酶產(chǎn)生菌株，經(jīng)搖瓶復(fù)篩，得到一株酶活最高的嗜堿細菌Z-16。經(jīng)16S rDNA序列比對和生理生化特征檢測，初步鑒定Z-16屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。對粗酶液性質(zhì)研究表明：Bacillussp.Z-16所產(chǎn)纖維素酶最適作

2、用pH7.0-7.5，在pH6.5-9.0的范圍有80％以上酶活，最適作用溫度為50℃；該酶具有良好的pH和溫度穩(wěn)定性，在pH3-10的條件下保存2h后，粗酶液仍能保持90％以上的酶活；Na+、K+和Mn2+對酶有明顯的激活作用，C02+、Hg2+、Cd2+和SDS抑制酶的活性，Zn2+和Cu2+使酶完全失活，而EDTA、Triton X-100和Tween20對酶活無顯著影響。
　　 對Bacillus sp.Z-16的搖瓶產(chǎn)

3、酶條件進行優(yōu)化，最佳產(chǎn)酶條件為：碳源為CMC-Na，氮源為酵母粉，初始培養(yǎng)pH9.0，培養(yǎng)基裝液量10％，接種量3％，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速120 rpm，培養(yǎng)36 h。優(yōu)化后，Bacillus sp.Z-16的纖維素酶酶活可達3.48 U/mL，是優(yōu)化前的7.5倍。
　　 通過對已發(fā)表的同源纖維素酶序列進行分析，設(shè)計引物，以Bacillus sp.Z-16基因組為模板，擴增得到含Z-16纖維素酶基因的DNA片段，經(jīng)克隆測序，

4、結(jié)果表明該酶基因ORF長2475 bp，編碼824個氨基酸。對演推的蛋白序列分析表明，該酶N端有30個氨基酸的信號肽，催化結(jié)構(gòu)域?qū)儆谔擒账饷傅?家族，C端為CBM_17_28家族的纖維結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該酶去除信號肽的成熟酶計算分子量88，181 Da，pI值為4.19。該酶的催化結(jié)構(gòu)域與日本投入應(yīng)用的洗滌用堿性纖維素酶Cel K有72％的同源性。
　　 將Z-16纖維素酶去除信號肽的全酶基因(gen2)和催化結(jié)構(gòu)域部分基因(gen

5、3)分別克隆至pET-28a(+)表達載體，在E.coli BL21(DE3)中進行高效表達。對重組酶Cel2和Cel3的胞外表達條件進行了優(yōu)化，當培養(yǎng)液菌濃A600達到0.8時，加入0.8mM的IPTG，37℃誘導(dǎo)16h后，Cel2和Cel3胞外酶活達到最高，分別為1.191 U/mL和9.307 U/mL，此時它們胞外比活分別為17.80 U/mg和45.13U/mg,
　　 重組酶Cel2和Cel3的胞外粗酶液經(jīng)超濾濃縮處

6、理后，進行His6標簽一步親和層析，得到純化的重組酶Cel2和Cel3，純化倍數(shù)分別為3.2和2.5倍，比活分別達到63.5 U/mg和89.0 U/mg。隨后對兩種純酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明：重組全酶Cel2的最適作用pH為7.5，在7.5-9.0的pH范圍有90％以上酶活，最適溫度50℃，均表現(xiàn)與粗酶液一致的特性；重組催化域Cel3的最適作用pH為7.5，在6.5-8.0的pH范圍有90％以上酶活，較Cel2偏酸了一個pH單位，而Cel

7、3的最適作用溫度提高至55-60℃；金屬離子、EDTA及表面活性劑對Cel2和Cel3的影響，均與對粗酶液的影響基本一致。此外，還測定了純酶的Km和Vmax，Cel2和Cel3分別為0.105 mmol/L和0.900 mmoI/L，0.05 mmol/L/min和0.280mmol/L/min.
　　 綜上所述，本研究首先通過篩選獲得一個產(chǎn)pH和溫度穩(wěn)定性良好的堿性纖維素酶的嗜堿芽孢桿菌，對其產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化，隨后克隆了纖維