桑疫病病原細菌纖維素酶基因的克隆及表達.pdf

1、纖維素是地球上分布最廣、含量最豐富的可再生性碳源化合物，但它的利用率較低。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)將纖維素酶的基因克隆到細菌、酵母、真菌和植物中以期得到高比活力的重組型纖維素酶。 桑細菌性疫病是危害桑樹幼枝、葉的一種主要病害，在我國蠶區(qū)普遍發(fā)生且危害較嚴重。通過對病原細菌的分離和測定其細菌學性狀后，明確了桑疫病病原細菌是一種丁香假單胞菌，屬于熒光假單胞菌屬(Pseudomonas syringae)，主要引起桑

2、樹幼枝的腐爛和斷裂等癥。丁香假單孢菌對植物的侵染主要通過細胞壁降解酶系統(tǒng)，在該復合酶中含有一種或多種纖維素酶，對增強病菌的致病力，降解細胞壁起到重要作用。 本試驗克隆了桑疫病菌中的纖維素酶基因，并在大腸桿菌中進行表達，以期得到生產(chǎn)高比活力的重組型纖維素酶的工程菌。 根據(jù)NCBI中丁香假單孢菌的纖維素酶序列設(shè)計特異引物(引入BamH I及EcoR I酶切位點)，采用PCR方法擴增纖維素酶基因，將酶切后的纖維素酶基因片段

3、連接到用相同酶切的pET28a載體上，進行測序分析。結(jié)果表明該全長肽基因讀碼框大小為1173 bp，編碼390個氨基酸。通過在NCBI中對氨基酸的比對結(jié)果表明，克隆的纖維素酶基因核心序列同源于內(nèi)切-β-1，4-D-葡聚糖酶。對氨基酸序列的在線分析表明，在N端具有信號肽。 根據(jù)該纖維素酶基因的結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建了全長和成熟肽的pET28a重組載體，分別轉(zhuǎn)化到受體菌大腸桿菌BL21，在IPTG誘導下進行表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE

4、電泳后，用Western Blotting和肽指紋圖譜方法檢測，分別得到分子量為42kD和35kD左右的兩條特異表達條帶，與全長肽基因和成熟肽基因的表達產(chǎn)物的理論值相符。收集誘導表達的菌體用NaAc-HAc緩沖液洗滌后，經(jīng)超聲波破碎，離心收集上清液，采用DNS法檢測不同反應條件下表達產(chǎn)物的酶活力。全長肽(P1/P2)在30-40℃范圍內(nèi)所測的酶活力隨著溫度的升高而增加，在40℃時達到最高，其后，則逐漸降低。而成熟肽(P3/P4)在30℃