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文檔簡介
1、纖維素是地球上分布最廣、含量最豐富的可再生性碳源化合物,但它的利用率較低。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,利用基因工程技術(shù)將纖維素酶的基因克隆到細菌、酵母、真菌和植物中以期得到高比活力的重組型纖維素酶。 桑細菌性疫病是危害桑樹幼枝、葉的一種主要病害,在我國蠶區(qū)普遍發(fā)生且危害較嚴重。通過對病原細菌的分離和測定其細菌學性狀后,明確了桑疫病病原細菌是一種丁香假單胞菌,屬于熒光假單胞菌屬(Pseudomonas syringae),主要引起桑
2、樹幼枝的腐爛和斷裂等癥。丁香假單孢菌對植物的侵染主要通過細胞壁降解酶系統(tǒng),在該復合酶中含有一種或多種纖維素酶,對增強病菌的致病力,降解細胞壁起到重要作用。 本試驗克隆了桑疫病菌中的纖維素酶基因,并在大腸桿菌中進行表達,以期得到生產(chǎn)高比活力的重組型纖維素酶的工程菌。 根據(jù)NCBI中丁香假單孢菌的纖維素酶序列設(shè)計特異引物(引入BamH I及EcoR I酶切位點),采用PCR方法擴增纖維素酶基因,將酶切后的纖維素酶基因片段
3、連接到用相同酶切的pET28a載體上,進行測序分析。結(jié)果表明該全長肽基因讀碼框大小為1173 bp,編碼390個氨基酸。通過在NCBI中對氨基酸的比對結(jié)果表明,克隆的纖維素酶基因核心序列同源于內(nèi)切-β-1,4-D-葡聚糖酶。對氨基酸序列的在線分析表明,在N端具有信號肽。 根據(jù)該纖維素酶基因的結(jié)構(gòu)特征,構(gòu)建了全長和成熟肽的pET28a重組載體,分別轉(zhuǎn)化到受體菌大腸桿菌BL21,在IPTG誘導下進行表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE
4、電泳后,用Western Blotting和肽指紋圖譜方法檢測,分別得到分子量為42kD和35kD左右的兩條特異表達條帶,與全長肽基因和成熟肽基因的表達產(chǎn)物的理論值相符。收集誘導表達的菌體用NaAc-HAc緩沖液洗滌后,經(jīng)超聲波破碎,離心收集上清液,采用DNS法檢測不同反應條件下表達產(chǎn)物的酶活力。全長肽(P1/P2)在30-40℃范圍內(nèi)所測的酶活力隨著溫度的升高而增加,在40℃時達到最高,其后,則逐漸降低。而成熟肽(P3/P4)在30℃
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