疏綿狀嗜熱絲孢菌熱穩(wěn)定纖維素酶的分離純化和基因克隆.pdf

1、纖維素酶是一組能降解纖維素的酶的總稱(chēng)。該酶廣泛存在于各種微生物中，如細(xì)菌、真菌、放線菌等；此外，在動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)該酶的存在。但到目前為止，對(duì)該酶的研究仍多以中溫好氣性木霉(Trichoderma)為主。因此，為了提高纖維素酶的產(chǎn)率和加速對(duì)纖維素酶降解纖維素機(jī)制的研究，一些極端條件下高活力的纖維素分解菌已經(jīng)引起科研工作者的重視，尤其是對(duì)嗜熱真菌(thermophilic fungi)的研究。嗜熱真菌具有產(chǎn)酶快且產(chǎn)量大、分解纖維素效率高等特性

2、，是一類(lèi)非常具有開(kāi)發(fā)潛力的纖維素分解菌。 疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一種廣泛分布的，生長(zhǎng)上限溫度較高的一種嗜熱真菌，本實(shí)驗(yàn)室從該菌中已分離了多種嗜熱酶，但還未分離到β-葡萄糖苷酶和外切β-葡聚糖纖維二糖水解酶。本研究中Thermomyces lanuginosus在以微晶纖維素為唯一碳源的合成培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生了外切β-葡聚糖纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶，通過(guò)硫酸銨沉淀、DEAE-Sep

3、harose Fast Flow陰離子層析、Phenyl-Sepharose疏水層析等步驟獲得了凝膠電泳均一的外切β-葡聚糖纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。經(jīng)12.5％SDS-PAGE和凝膠過(guò)濾層析方法測(cè)得兩種酶的分子量大小分別約為46.6kDa和47kDa及118kDa和120kDa。 外切β-葡聚糖纖維二糖水解酶的反應(yīng)最適溫度為60℃，最適pH值為5.0，在60℃保溫30min活性喪失5％，在70℃時(shí)的半衰期為35min，在

4、80V保溫10min仍具有60％的活性，80℃下酶的半衰期為25min，在90℃下保溫10min仍有12％的活性。Na<'+>K<'+>、Mn<'3+>對(duì)外切β-葡聚糖纖維二糖水解酶活性影響不大；Ca<'2+>、Ba<'2+>、Mg<'2+>離子對(duì)酶有明顯的激活作用，Ag<'+>、Zn<'2+>、NH<,4><'+>等對(duì)酶有抑制作用。該酶的Km值為9.56 mg/mL,Vmax為22.12 mg/mL.min。 β-葡萄糖苷酶的

5、反應(yīng)最適溫度為60℃，最適pH值為5.0，在60℃保溫1小時(shí)活性基本不喪失，在70℃的半衰期是15min，在80℃保溫10min仍具有30％的活性。在90℃下保溫10min仍有10％的活性。Ca<'2+>、Ba<'2+>、 Mg<'2+>對(duì)β-葡萄糖苷酶有激活作用，Na<'+>、K<'+>、Mn<'2+>對(duì)酶活性影響不大，而Ag<'+>、NH<,4><'+>、Zn<'2+>對(duì)酶有顯著的抑制作用。該酶的Km值為1.98mg/mL，Vmax

6、為11.94mg/mL.min。 根據(jù)12種真菌熱穩(wěn)定外切葡聚糖酶的同源保守序列設(shè)計(jì)兼并性引物，通過(guò)RT-PCR及快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法，克隆了疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyceslanuginosus外切葡聚糖酶的編碼基因cbh，全長(zhǎng)cDNA為1710bp，包含一個(gè)由457個(gè)氨基酸組成的開(kāi)放閱讀框。通過(guò)Signal．P服務(wù)器的SignalP-NN和SignalP-HNN兩種軟件我們對(duì)推測(cè)的外切β-葡聚糖纖維二