降解纖維素嗜熱菌的篩選及其功能基因克隆.pdf

1、福建農(nóng)林大學碩士學位論文降解纖維素嗜熱菌的篩選及其功能基因克隆姓名：陳路劼申請學位級別：碩士專業(yè)：微生物學指導教師：吳祖建劉斌20080401福建農(nóng)林大學碩士學位論文降解纖維素嗜熱菌的篩選及其功能基因克隆，摘要本研究從福建永泰縣溫泉的水樣、土樣及木料樣品中分離到60株嗜熱細菌。采用菌體全蛋白SDSPAGE和16SrDNA序列分析結(jié)合的鑒定方法，將它們歸類為8種細菌，分屬于五個屬中的八個種：Geobacillusstearothermop

2、hi]us，GeobacniUSkaustophJ]us、Geobacillustlermocatenu]atus、Geobacillusthermo]eovorans、Anoxybacilluskualawohkensis、Thermussp，Meiothermussp、／Lranico]asp。嗜熱微生物及其嗜熱酶在工業(yè)和分子生物學等方面有重要的用途。在能源逐漸枯竭的今天，纖維素酶的研究對利用纖維素這一具有巨大潛力的可再生資源有著重

3、要的意義。本研究篩選到2株產(chǎn)胞外纖維素酶嗜熱茵DTM7和TC—S8，經(jīng)鑒定分別為酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)和嗜熱芽孢桿菌(OeobacYllussp)。對Geobacillussp菌株TCS8產(chǎn)胞外纖維素酶的發(fā)酵條件進行研究，結(jié)果表明：在培養(yǎng)基的初始為pH65，溫度為60。C，裝液量20％，接種量2％，搖床轉(zhuǎn)速為120r／min的條件下培養(yǎng)36h時，產(chǎn)酶量達到最大。菌株TCS8分泌

4、的纖維素酶最適作用溫度為6070。C，最適pH為7O。利用HPLC法分析纖維素酶降解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其中主要為葡萄糖，含有少量纖維二糖，葡萄糖是由B葡萄糖苷酶將纖維二糖水解的產(chǎn)物，說明菌株TCS8除了分泌內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，還分泌B葡萄糖苷酶，構(gòu)成復合的纖維素酶體系。菌株TCS8的B葡萄糖苷酶GL基因克隆結(jié)果表明，該DNA片段長1415nt。最大開放閱讀框編碼470個氨基酸。該序列與GeobacilluskaustophilusHTA

5、426和嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80—2(6eobacillusthermodenitrificansNG80—2)的8葡萄糖苷酶基因序列同源性分別達到90％和89％。利用系統(tǒng)發(fā)育樹分析，菌株TCS8的GL序列、6eobacilluskaustophilusHTA426和6eobacillusthermodenitrificansNG80—2的p葡萄糖苷酶基因序列處于同一分支上。該基因的克隆，為構(gòu)建降解纖維素的工程菌奠定基礎。關鍵詞：嗜熱菌