mba論文枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶的定向進(jìn)化及其代謝工程應(yīng)用pdf

1、 枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶的定向 枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶的定向進(jìn)化及其代謝工程應(yīng)用 進(jìn)化及其代謝工程應(yīng)用 Directed Evolution of Adenylosuccinate Synthetase and Its Application in Metabolic Engineering 學(xué)科專業(yè)：生物化工 研 究 生：王 曉 玥 指導(dǎo)教師：趙 學(xué) 明 教授 天津大學(xué)化工學(xué)院 二零一五年五月 摘 要 枯草芽孢桿菌中，p

2、urA 基因編碼的腺苷琥珀酸（Adenylosuccinate，sAMP）合成酶催化 IMP 生成 sAMP， 是重要的節(jié)點(diǎn)流量控制關(guān)鍵酶。 然而在已有的文獻(xiàn)報道中，purA 基因的失活盡管能夠提高肌苷、鳥苷以及核黃素等的產(chǎn)量，但對菌體的生長都產(chǎn)生了極大影響， 不僅造成后續(xù)的基因操作變得困難， 同時也延長了發(fā)酵周期。本研究通過前期實(shí)驗數(shù)據(jù)和分子模擬預(yù)測結(jié)果，尋找 purA 基因關(guān)鍵突變點(diǎn)， 構(gòu)建點(diǎn)飽和突變文庫， 進(jìn)一步以突變株的生長和核

3、黃素產(chǎn)量為考察指標(biāo)， 篩選到 sAMP 合成酶的最優(yōu)滲漏突變， 并研究了該滲漏突變在枯草芽孢桿菌合成肌苷中的代謝工程應(yīng)用。 本研究首先構(gòu)建了木糖操縱子誘導(dǎo)的 comK 過表達(dá)菌 SS2，作為點(diǎn)飽和突變文庫的宿主菌；隨后，構(gòu)建了含有新霉素抗性基因及 purAC725T 基因片段的點(diǎn)飽和突變模板質(zhì)粒 pSSN-purA。進(jìn)一步利用全質(zhì)粒擴(kuò)增的方法，構(gòu)建 Pro242 或Thr238 位點(diǎn)的點(diǎn)飽和突變文庫。根據(jù)突變株的生長狀況和核黃素產(chǎn)量得到

4、最優(yōu)突變型 P242N。 P242N 突變型菌株的生長狀態(tài)與野生型幾乎一致， 且其酶活較野生型降低了 53.6%。說明了 P242N 突變型的 sAMP 合成酶的酶活部分降低，能夠在保證菌體正常生長的同時，提高了 IMP 流向 GMP 的通量。 進(jìn)一步選擇肌苷作為目的產(chǎn)物， 考察 P242N 突變對嘌呤代謝途徑小分子代謝物產(chǎn)量的影響。首先通過敲除 purR、過表達(dá) purF 解調(diào)嘌呤代謝途徑；隨后，敲除肌苷分解途徑基因 deoD 和 p