產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌代謝工程的研究.pdf

1、本文通過敲除ptsG基因和構(gòu)建不同的質(zhì)粒得到一系列產(chǎn)琥珀酸的Escherichia coli基因工程菌,研究了在大腸桿菌中磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)、半乳糖協(xié)同運(yùn)輸體系和磷酸戊糖途徑的葡萄糖脫氫酶對(duì)大腸桿菌琥珀酸合成的影響,成功地通過敲除ptsG基因和擴(kuò)增galp、glk、gdh基因改變了工程菌株琥珀酸的合成能力.最后本文建立了Escherichia coli的厭氧生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò),對(duì)野生型大腸桿菌W1485和ptsG敲除菌株TLIQ2和TU

2、Q2/pQZ3的代謝通量分布作了比較分析.得到的主要結(jié)果如下: 利用Red同源重組技術(shù),構(gòu)建ptsG基因缺陷株TLJQ2在厭氧情況下,敲除菌株nJQ2的琥珀酸產(chǎn)量是原始菌株W1485的5倍,乳酸、甲酸、乙酸和乙醇這些主要副產(chǎn)物的產(chǎn)量都有不同程度的下降. ptsG基因的缺失能夠提高琥珀酸的產(chǎn)量,但它會(huì)減慢葡萄糖的吸收速率,從而導(dǎo)致菌株的生長(zhǎng)緩慢.因此我們構(gòu)建了質(zhì)粒pQZ3和pQZ4,分別表達(dá)了galp和glk兩個(gè)基因,而當(dāng)

3、大腸桿菌用半乳糖協(xié)同運(yùn)輸體系時(shí),借助半乳糖滲透酶(galp)運(yùn)輸糖到胞內(nèi),同時(shí)葡萄糖激酶(glk)將其磷酸化,提高了厭氧發(fā)酵時(shí)葡萄糖的吸收速率和菌體細(xì)胞生長(zhǎng)速率,但合成琥珀酸的能力沒有變化. 通過NADH的再生提供更多的還原力可以使琥珀酸的轉(zhuǎn)化率得到提高,即提高大腸桿菌產(chǎn)NADH的能力.從枯草芽孢桿菌.Bacillus subtilis 168中克隆出葡萄糖脫氫酶基因片段,整合到質(zhì)粒pET28a(+)中并在大腸桿菌在中進(jìn)行表達(dá),