應(yīng)用系統(tǒng)代謝工程方法改進(jìn)產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的研究.pdf

1、本文系統(tǒng)分析了三株不同核黃素產(chǎn)量B.subtilis工程菌株的代謝特征，揭示了菌株產(chǎn)核黃素的內(nèi)在遺傳機(jī)理，同時(shí)構(gòu)建了一系列產(chǎn)核黃素B.subtilis基因工程菌，得到的主要結(jié)果如下：
　　 發(fā)現(xiàn)purF基因采用不同的整合方式對(duì)菌體代謝的影響有明顯差異，原因在于采用雙交換整合機(jī)理構(gòu)建的系列工程菌中僅purF基因表達(dá)水平提高；而采用單交換整合機(jī)理構(gòu)建的系列工程菌中不僅purF基因而且其下游purM、purN、purH、purD基因的

2、表達(dá)水平皆有不同程度的提高，這些基因的編碼產(chǎn)物可催化更多的嘌呤前體物谷氨酰胺、甘氨酸、10-甲醛四氫葉酸(10-Formyl-THF)進(jìn)入嘌呤途徑，故其對(duì)菌體代謝影響較大。
　　 從基因表達(dá)水平上揭示產(chǎn)核黃素工程菌的主要特點(diǎn)，確定了產(chǎn)核黃素菌株應(yīng)具有的有利表型：表達(dá)增強(qiáng)顯著的核黃素操縱子，將加強(qiáng)核黃素合成途徑；citZ基因及副產(chǎn)物形成有關(guān)的基因的下調(diào)，可避免溢流代謝、減少副產(chǎn)物生成；采取谷氨酸脫氫酶催化的途徑利用氮源(NH4+)

3、能節(jié)約菌的能量消耗；葡萄酸支路可提供充足的核黃素合成起始物5-磷酸核酮糖；采用能量耦合效率高的aa3氧化酶來(lái)產(chǎn)生能量，可有效改善能量供給。
　　 以工程菌RH33和RH44為親株，增強(qiáng)表達(dá)PRPP合成酶及核糖-5-磷酸異構(gòu)酶可提高胞內(nèi)PRPP濃度，促進(jìn)Purr調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而促使胞內(nèi)更多的嘌呤核苷酸、谷氨酰胺、一碳單位、甘氨酸、二氧化碳和天冬氨酸等核黃素前體物合成途徑加強(qiáng)并參與到核黃素合成途徑，核黃素合成能力分別提高20％和

4、3.4％。
　　 核黃素合成過(guò)程中，需要1分子的DARPP(長(zhǎng)途徑提供)和2分子的DHPB(短途徑提供)生成1分子的核黃素。增加PRPP濃度雖然一方面加強(qiáng)了前體物的供給，另一方面解除了對(duì)嘌呤及甘氨酸合成途徑等PurR調(diào)控基因的抑制，但這兩方面作用僅僅在于提高GTP合成途徑(長(zhǎng)途徑)的通量，沒有緩解存在的前體物供給不平衡，RH44對(duì)此尤為敏感。為平衡前體物供給以提高核黃素生產(chǎn)，在RH44中增強(qiáng)表達(dá)3,4-二羥基磷酸丁酮(DHPB)