基于分子進化和代謝工程的產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌的構(gòu)建.pdf

1、本文報道了將分子進化與代謝工程結(jié)合,指導(dǎo)大腸桿菌的改造以生產(chǎn)琥珀酸的研究。首先,用分子進化的方法研究了多巴胺代謝途徑中酶基因以及相關(guān)受體基因的進化規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn),代謝途徑下游的酶基因比上游酶基因的進化速率快:多巴胺的合成代謝下游的酶基因ddc的進化速率是上游酶基因pah的1.699倍。多巴胺降解途徑下游的酶基因comt的進化速率是最上游酶基因maoa的1.926倍。酶基因同義位點受到的選擇壓力低于非酶基因,且不同酶基因同義位點受到的選擇

2、壓力不同。
　　進一步將分子進化的結(jié)果指導(dǎo)大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸的代謝工程。同義位點選擇壓力分析顯示,4個催化C3→C4的基因所受選擇壓力的順序為:pyc(谷氨酸棒桿菌)>maeB(大腸桿菌)>maeA(大腸桿菌)>pyc(枯草芽孢桿菌)。分子進化的研究預(yù)測,4個基因的WD3菌株琥珀酸得率的影響由大到小依次為:pyc(谷氨酸棒桿菌),maeB(大腸桿菌),maeA(大腸桿菌),pyc(枯草芽孢桿菌)。將上述的4個基因在WD3表達后,琥

3、珀酸得率分別達到了1.15molmol-1(每代謝1mol葡萄糖,產(chǎn)生1.15mol琥珀酸),0.48molmol-1,0.38molmol-1,0.27molmol-1—發(fā)酵的結(jié)果證實了分子進化的預(yù)測。pepc和pepck基因的過表達使得WD3的琥珀酸得率分別達到了0.688molmol-1和0.426molmol-1。
　　表達谷氨酸棒桿菌pyc基因的WD3菌株仍然合成丙酮酸(0.72gL-1)、乳酸(0.22gL-1)、甲酸

4、(1.41gL-1)和乙酸(0.52gL-1)。通過3種方法進一步抑制有機酸副產(chǎn)物的產(chǎn)生:1)敲除WD3菌株的pflB-focA基因得到的JPJ05C菌株的琥珀酸得率為1.79molmol-1,發(fā)酵液中丙酮酸、乳酸、甲酸和乙酸的濃度也分別降低為0.46gL-1,0.11gL-1,0gL-1,0.12gL-1。敲除ptsI和pepck基因?qū)τ阽晁岬寐视绊懖淮?。三個基因的組合敲除可以有效地提高琥珀酸的得率;2)共表達大腸桿菌pepc和谷氨

5、酸棒桿菌的pyc基因使得JPJ05C菌株的乳酸、甲酸和乙酸副產(chǎn)物的產(chǎn)量均為0gL-1,丙酮酸積累也顯著降低(0.02gL-1);3)表達琥珀酸合成途徑的下游基因fumA和mdh基因也可以降低有機酸副產(chǎn)物的積累。
　　探討了還原力對大腸桿菌合成琥珀酸的影響。磷酸戊糖途徑可以提供還原力,因此過表達了點突變以后的谷氨酸棒桿菌的zwf和gnd基因可能會提高大腸桿菌琥珀酸的生產(chǎn)。過表達大腸桿菌pepc基因的WD3菌株的琥珀酸得率為0.68m