高產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌的代謝工程.pdf

1、琥珀酸因為其作為大規(guī)?；ぴ蠎?yīng)用的潛力已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注.而發(fā)酵菌種是由可再生原料生產(chǎn)琥珀酸的關(guān)鍵之一.本文以代謝工程理論為指導(dǎo),構(gòu)建了一系列基因工程大腸桿菌,較系統(tǒng)的研究和改良了大腸桿菌的產(chǎn)琥珀酸特性,得到的主要結(jié)果如下: 大腸桿菌ptsG敲除株TuQ2和野生菌相比生理和發(fā)酵特性均發(fā)生了很大變化.具體表現(xiàn)在琥珀酸的產(chǎn)量提高4倍以上,而葡萄糖消耗速率和菌體生長速率明顯趨緩.通過表達(dá)半乳糖滲透酶可使TUQ2的生長速度加快,并達(dá)到

2、比較高的最后菌濃度,琥珀酸的得率仍舊和TUQ2保持相同的水平；相反,表達(dá)葡萄糖激酶對TUQ2的生長和代謝產(chǎn)物的分泌都沒有很大的影響.進(jìn)一步在TUQ2中表達(dá)丙酮酸羧化酶能夠?qū)㈢晁岬牡寐侍岣叩礁叩?.15 mol/mol葡萄糖,而乙酸,乙醇和甲酸也均較TUQ2有一定程度的上升.通過半乳糖滲透酶和丙酮酸羧化酶的共表達(dá),可以將TUQ2葡萄糖的消耗速率從0.33 g/L·h提高到0.6 g/L·h,同時保持相同的琥珀酸得率. 本文還成

3、功構(gòu)建了表達(dá)假絲酵母甲酸脫氫酶的質(zhì)粒pQZ8.野生大腸桿菌中表達(dá)甲酸脫氫酶后,菌體對葡萄糖的消耗更快,乙醇的得率提高很多,琥珀酸的產(chǎn)量變化卻很小.在琥珀酸高產(chǎn)菌株TUQ2以及adhE敲除菌TUQ5中表達(dá)甲酸脫氫酶并沒有使琥珀酸的產(chǎn)量增加,相反琥珀酸的產(chǎn)量大幅度下降. 通過GAMS軟件,以基因組規(guī)模的大腸桿菌代謝模型iJR904 GSM/GPR為基礎(chǔ),進(jìn)行琥珀酸得率最大化線性規(guī)劃.預(yù)測琥珀酸的最大理論得率為1.71mol/mol葡

4、萄糖,并找到了一條理論最優(yōu)產(chǎn)琥珀酸途徑.經(jīng)過TUQ2,W1485/pQZ6以及TUQ2/pQZ6三株菌的代謝通量分析濕實驗結(jié)果和理論最優(yōu)產(chǎn)琥珀酸途徑的比較后,發(fā)現(xiàn)了進(jìn)一步目標(biāo)改造靶點為羧化途徑和乙醛酸循環(huán).其中乙醛酸循環(huán)的通量和琥珀酸的產(chǎn)率有很大的關(guān)系. 對乙醛酸靶點進(jìn)行改造,構(gòu)建了iclR系列敲除菌TUQ8和TUQ19.通過對其發(fā)酵和生長的研究得出結(jié)論:iclR基因敲除使菌體厭氧發(fā)酵的最終菌體量增大和乙酸的產(chǎn)率降低.在TUQ1