透明顫菌血紅蛋白在產(chǎn)聚γ-谷氨酸地衣芽胞桿菌WX-02中的表達.pdf

1、聚γ-谷氨酸(polyγ-glutamicacid；γ-PGA)是一種應(yīng)用前景良好的生物高分子材料。地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)WX-02是γ-PGA的產(chǎn)生菌，其發(fā)酵液由于較粘稠而導(dǎo)致溶氧很差，溶氧成為γ-PGA產(chǎn)量提高的限制性因素之一。透明顫菌血紅蛋白(VHb)是一種來源于原核生物的氧結(jié)合蛋白。本研究旨在B.licheniformisWX-02中表達透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)來改善其發(fā)酵過程中氧的利用

2、效率，進而改善菌體生長，提高產(chǎn)量。 本研究構(gòu)建了能整合于芽胞桿菌染色體上的表達載體pDG1730-vgb，其含有芽胞桿菌α-淀粉酶基因的整合位點，通過Spizizen感受態(tài)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入B.licheniformisWX-02中，PCR驗證表明vgb成功整合到其染色體上；經(jīng)CO差光光譜分析，重組菌株B.licheniformisM2有VHb表達活性；搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果顯示，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，發(fā)酵36h的條件下，250mL三角瓶

3、中發(fā)酵液裝液量為50mL時，M2的生物量和γ-PGA產(chǎn)量分別為4.5g/L和27.71g/L，高于出發(fā)菌株WX-026.43％和6.74％；裝液量為100mL時，M2發(fā)酵的生物量和γ-PGA產(chǎn)量分別為4.17g/L和26.59g/L，高于出發(fā)菌株WX-0215.02％和21.7％。vgb的表達促進了菌體和γ-PGA產(chǎn)量的增長，產(chǎn)物比生物量的增長明顯，促進效果隨著供氧條件的降低而增加。3L發(fā)酵罐分批發(fā)酵結(jié)果顯示，攪拌轉(zhuǎn)速為600r/min

4、，通氣量為2L/min時，M2的生物量(OD600)達到7.39，比出發(fā)菌株WX-02提高了25.5％，γ-PGA產(chǎn)量達到33.5g/L，比WX-02提高了20％，進一步證實VHb蛋白的表達對γ-PGA產(chǎn)量和菌體生長的促進作用。 整合載體pDG1730-vgb在高產(chǎn)γ-PGA的枯草芽胞桿菌W003中的整合表達已有初步結(jié)果，本研究還構(gòu)建了另一個整合載體psacB-vgb，含有枯草芽胞桿菌果聚糖酶基因(sacB)的整合位點，其在高產(chǎn)