透明顫菌血紅蛋白基因在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628中的表達.pdf

1、豐加霉素(Toyocamycin)是核苷類抗生素家族的重要成員,其在農(nóng)業(yè)植物病害防治領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價值。為改善豐加霉素產(chǎn)生菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes1628)發(fā)酵過程溶氧限制,旨在實現(xiàn)vgb基因在S.diastatochromogenes1628中的AcerOBP11基因以促進豐加霉素的生物合成。
　　首先,嘗試了PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,電擊轉(zhuǎn)化,接合轉(zhuǎn)移三種遺傳轉(zhuǎn)

2、化方法在S.diastatochromogenes1628的應(yīng)用,并分別對其條件進行了優(yōu)化。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的最優(yōu)條件為:用CP培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中加入1％的甘氨酸培養(yǎng)48h,用3mg/mL的溶菌酶酶解1h制得的原生質(zhì)體在R2YE培養(yǎng)基上再生和轉(zhuǎn)化的效率最高。在濃度為30%(w/v)的PEG1000介導(dǎo)下,1×109/mL的原生質(zhì)體與1μg的pIJ702質(zhì)粒,可獲得最高轉(zhuǎn)化效率:4.8×103轉(zhuǎn)化子/μg DNA。電擊轉(zhuǎn)化的最優(yōu)條件為:用預(yù)處理

3、的菌絲體作為電擊處理的對象,用PGS緩沖液,電擊條件為:25μF,200Ω,12kV/cm,轉(zhuǎn)化效率最高為(3±0.4)×104轉(zhuǎn)化子/μg DNA。接合轉(zhuǎn)移的最優(yōu)條件為:用預(yù)萌發(fā)的孢子作為受體,與供體菌ET12567(pUZ8002)按108:108的濃度混合涂布,16-20h后,用1mL終濃度均為50μg/mL的安普霉素和萘啶酮酸水溶液覆蓋平板,最終得到348個接合子。
　　其次,基于載體 pIB139,以gfp為報告基因檢測

4、紅霉素抗性基因啟動子PermE*在S. diastatochromogenes1628中的轉(zhuǎn)錄活性,重組菌1628-GFP在熒光顯微鏡下觀察顯示,菌絲可發(fā)出穩(wěn)定明亮的綠色熒光,表明啟動子PermE*在菌株1628中可有效啟動外源基因的表達。在此基礎(chǔ)上,利用PermE*實現(xiàn)vgb基因的異源表達。重組菌1628-VHB通過CO-差光譜分析顯示VHb具有生物學(xué)活性;搖瓶實驗表明:與原始菌株相比,重組菌可促進豐加霉素產(chǎn)量的提高,在中度和高度限氧