脂肪酶Lip906的定向進化及固定化研究.pdf

1、分類號：分類號：___________密級密級:__________UDC:___________脂肪脂肪酶Lip906Lip906的定向進化及固定化研究的定向進化及固定化研究TheMoleculardirectedevolutionimmobilizationfthelipaseLip906姓名：陳小利學號：2111440066院系：藥學院專業(yè)：微生物與生化藥學研究方向：微生物與分子生物學導(dǎo)師姓名：李荷（教授）論文提交日期：2017年

2、4月論文答辯日期：2017年5月學位授予單位：廣東藥科大學二○一七年四月廣東藥科大學碩士研究生學位論文脂肪脂肪酶Lip906Lip906的定向進化及固定化研究的定向進化及固定化研究摘要摘要脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一類能夠特異性催化水解三酰甘油的酶，在微生物以及動植物中廣泛存在，但來源于微生物的脂肪酶由于其活性及穩(wěn)定性達不到工業(yè)生產(chǎn)的需求而限制其應(yīng)用，因此諸多蛋白改造技術(shù)應(yīng)運而生。實室前期通過構(gòu)建土壤宏基因組文庫篩選得

3、到的一個全長906bp的新型脂肪酶基因，將其命名為Lip906。由于其熱穩(wěn)定性達不到工業(yè)生產(chǎn)的需求，本研究通過易錯PCR技術(shù)對其分子結(jié)構(gòu)進行改造，通過酶的固定化提高其熱穩(wěn)定性。通過易錯PCR技術(shù)構(gòu)建突變文庫，最終篩選得到酶活提高的突變脂肪酶Lip5D，其發(fā)生了兩個堿基突變，一個為同義突變：G831A；一個為錯義突變：A155G，對應(yīng)的氨基酸改變?yōu)镼52R。突變酶Lip5D的酶活提高4倍，最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH為7.5；突變酶

4、Lip5D在65C以下保溫2h仍能保持70%左右的相對酶活，在不同pH(3~10)保溫2h后仍能保持60%左右的相對酶活，其溫度穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性都有所提高，表明利用易錯PCR技術(shù)對酶的分子結(jié)構(gòu)進行改造是可行的。游離酶對外界環(huán)境敏感、反應(yīng)過程不好控制且游離酶不能循環(huán)回收利用，本文利用酶的固定化技術(shù)對突變酶Lip5D進行研究。結(jié)果顯示，殼聚糖對突變酶Lip5D游離酶的固定化效果最佳，酶活回收率能達到92%。其最適反應(yīng)溫度為63℃，最適反應(yīng)