第八章酶定向進(jìn)化

1、第八章 酶定向進(jìn)化,（一）教學(xué)目的與要求：　1、掌握：酶定向進(jìn)化的特點(diǎn)?！?、熟悉：酶基因的隨機(jī)突變?！?、了解：酶突變基因的定向選擇。（二）教學(xué)重點(diǎn)：易錯(cuò)PCR技術(shù)、ＤＮＡ重排技術(shù)、交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)、隨機(jī)引物體外重組技術(shù)、基因家族重排技術(shù)概念及特點(diǎn)?！‰y點(diǎn)：酶基因的隨機(jī)突變。（三）課時(shí)安排：2課時(shí)（四）教學(xué)方法：講授法；多媒體教學(xué),,1993年,美國(guó)科學(xué)家Arnold F H首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念,并用于天然

2、酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶.,定向進(jìn)化,定向進(jìn)化是模擬自然進(jìn)化的過(guò)程，進(jìn)行人工隨機(jī)突變，并在特定的環(huán)境條件下進(jìn)行選擇，使進(jìn)化朝著人們所需要的方向發(fā)展的技術(shù)過(guò)程。分為分子定向進(jìn)化和細(xì)胞定向進(jìn)化,細(xì)胞定向進(jìn)化,細(xì)胞定向進(jìn)化是在細(xì)胞水平上進(jìn)行定向進(jìn)化的過(guò)程，以各種細(xì)胞為進(jìn)化對(duì)象，通過(guò)人工隨機(jī)突變，改良細(xì)胞的各種特征，主要包括微生物細(xì)胞的定向進(jìn)化、動(dòng)物細(xì)胞的定向進(jìn)化、植物細(xì)胞的定向進(jìn)化等。,分子定向進(jìn)化,分子定向進(jìn)化是在分子水平上進(jìn)行定向進(jìn)化

3、的過(guò)程。通過(guò)從細(xì)胞內(nèi)提取或者通過(guò)PCR等方法獲得目標(biāo)分子的基因，在體外進(jìn)行人工隨機(jī)突變，然后進(jìn)行定向選擇而獲得所需突變體。,酶分子定向進(jìn)化,簡(jiǎn)稱(chēng)酶定向進(jìn)化，是模擬自然進(jìn)化過(guò)程（隨機(jī)突變和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫(kù)，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇具有優(yōu)良催化特征的酶的突變體的技術(shù)過(guò)程。,酶定向進(jìn)化的基本過(guò)程,,酶基因,,隨機(jī)突變,,構(gòu)建突變基因文庫(kù),,,篩選,,負(fù)突變基因,,正突變基因,,進(jìn)化酶,,

4、,反復(fù)進(jìn)行,第一節(jié)　酶基因的隨機(jī)突變,1、 易錯(cuò)PCR技術(shù)2、ＤＮＡ重排技術(shù)3、基因家族重排技術(shù)基因隨機(jī)突變方法的特點(diǎn)P207表8－1隨機(jī)突變方法可以聯(lián)合使用，交叉進(jìn)行，通過(guò)多次試驗(yàn)，反復(fù)篩選，以完成對(duì)酶的定向進(jìn)化。,一 、易錯(cuò)PCR技術(shù),從酶的單一基因出發(fā)，在改變反應(yīng)條件的情況下進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），使擴(kuò)增得到的基因出現(xiàn)堿基配對(duì)錯(cuò)誤，從而引起基因突變的技術(shù)過(guò)程?！　】梢酝ㄟ^(guò)提高鎂離子濃度、添加一定濃度的錳離子、改變

5、4種底物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）的濃度比等反應(yīng)條件，使DNA聚合酶在催化基因擴(kuò)增時(shí)，增加堿基配對(duì)錯(cuò)誤的出現(xiàn)頻率。,,特點(diǎn),基因突變發(fā)生在單一分子內(nèi)，為無(wú)性進(jìn)化。操作簡(jiǎn)便、隨機(jī)突變豐富。正突變的概率低，突變基因文庫(kù)較大，文庫(kù)篩選的工作量大，一般適用于較小基因的定向進(jìn)化。因此要控制好突變率，一般一個(gè)目的基因錯(cuò)配堿基數(shù)目應(yīng)控制在2~5個(gè),二、 DNA重排技術(shù),由美國(guó)Stemmer 于1994 年首次提出一項(xiàng)體外重組技術(shù)

6、概念：又稱(chēng)為DNA改組技術(shù)，是從正突變基因文庫(kù)中分離得到同源DNA，用酶切割成隨機(jī)片斷，經(jīng)過(guò)不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過(guò)程。,,DNA重排技術(shù)的基本過(guò)程,,兩條以上正突變基因,,DNA隨機(jī)片斷,,突變基因,,構(gòu)建突變基因文庫(kù),,篩選,,負(fù)突變基因,,正突變基因,,進(jìn)化酶,,,酶切,（反復(fù)進(jìn)行）,無(wú)引物PCR,基因重組,酶切,,特點(diǎn),DNA重排技術(shù)將兩條或多條正突變基因結(jié)合在一起，通過(guò)堿基重

7、排形成新的突變基因，為有性進(jìn)化正突變率高，進(jìn)化速度較快。（DNA重排技術(shù)是在原有正突變的基礎(chǔ)上進(jìn)行）操作過(guò)程要去除DNase Ⅰ，使操作復(fù)雜化。,,1）交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)： 在同一個(gè)反應(yīng)體系中以?xún)蓚€(gè)或多個(gè)相關(guān)的DNA片斷為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，把PCR反應(yīng)中常規(guī)的退火和延伸合并為一步，縮短反應(yīng)時(shí)間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過(guò)程反復(fù)進(jìn)行，直到產(chǎn)生完整的

8、基因長(zhǎng)度。,,交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)特點(diǎn),省去了用DNA酶切割成片段這一步，簡(jiǎn)化了DNA重排方法。交錯(cuò)延伸法重組發(fā)生在單一試管中，不需分離親本DNA和產(chǎn)生的重組DNA。,,2）隨機(jī)引物體外重組技術(shù)采用單鏈DNA為模板，配合若干條隨機(jī)序列的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)生若干個(gè)與模板不同部分的序列互補(bǔ)DNA小片斷，然后除去模板，這些DNA小片斷互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)堿基序列的重新排布而獲得全長(zhǎng)突變基因。,,三、基因家族重排技術(shù),概念：又稱(chēng)為

9、基因家族改組技術(shù)，是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用酶(DNase Ⅰ)切割成隨機(jī)片斷，經(jīng)過(guò)不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基因突變的技術(shù)過(guò)程。,基因家族：是來(lái)源于同一個(gè)祖先，由一個(gè)基因通過(guò)基因重復(fù)而產(chǎn)生兩個(gè)或更多的拷貝而構(gòu)成的一組基因，它們結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)、進(jìn)化上同源。,,基因家族重排技術(shù)的基本過(guò)程,,基因家族若干同源基因,,酶切,DNA隨機(jī)片斷,,突變基因,,突變基因文庫(kù),基因重組,,篩選,,負(fù)突變基

10、因,,正突變基因,,進(jìn)化酶,無(wú)引物PCR,,,酶切,反復(fù)進(jìn)行,DNA家族重排技術(shù)與DNA重排技術(shù)的異同點(diǎn),相同點(diǎn)：DNA家族重排技術(shù)與DNA重排技術(shù)的過(guò)程大致相同，都要經(jīng)過(guò)基因的隨機(jī)切割、無(wú)引物PCR等步驟以獲得突變基因，然后經(jīng)過(guò)構(gòu)建突變基因文庫(kù)、采用高通量篩選技術(shù)篩選獲得正突變基因。不同點(diǎn)： DNA家族重排技術(shù)從基因家族的若干同源基因出發(fā)進(jìn)行DNA序列的重新排布，而DNA重排技術(shù)則從采用易錯(cuò)PCR等技術(shù)所獲得的兩個(gè)以上的正突變基因出

11、發(fā)進(jìn)行DNA序列的重新排布。,第二節(jié) 酶突變基因的定向選擇,突變基因的定向選擇基本過(guò)程,突變基因,基因載體,,,,突變基因文庫(kù),基因重組,,篩選,,目的基因,一 、酶突變基因文庫(kù)的構(gòu)建,（一）構(gòu)建基因文庫(kù)的質(zhì)量要求1、文庫(kù)的包容性:指構(gòu)建的文庫(kù)必須盡可能地包含基因的任何一種可能的突變信息。2、文庫(kù)的完整性：指文庫(kù)中包含的DNA片斷必須盡可能完整地反應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)和功能信息，以便通過(guò)篩選得到的突變基因能夠通過(guò)表達(dá)獲得完整的具有催化功能的

12、進(jìn)化酶。,（二）構(gòu)建突變基因文庫(kù)的主要過(guò)程,1、載體的選擇載體的基本特點(diǎn):能自主復(fù)制；具有2個(gè)以上的遺傳標(biāo)記，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱(chēng)為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。,1）質(zhì)粒載體：質(zhì)粒載體是人工改造后的質(zhì)粒，具有自主復(fù)制起點(diǎn)、兩種以上易于檢測(cè)的選擇性標(biāo)記、多種限制性?xún)?nèi)切酶的單一位點(diǎn)等特點(diǎn)。,,. ori 復(fù)制起點(diǎn).tctr　四環(huán)素基因.Ampr

13、 氨芐青霉素抗性基因.P 啟動(dòng)子T　終止子,（二）構(gòu)建突變基因文庫(kù)的主要過(guò)程,2）噬菌體DNA載體：由噬菌體DNA改造而成的具有自我復(fù)制能力的載體。3）黏粒載體：是一類(lèi)人工構(gòu)建的含有λDNA黏性末端和質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒載體，又稱(chēng)為柯斯質(zhì)粒。4）噬菌粒載體：是一類(lèi)人工構(gòu)建的由M13噬菌體單鏈DNA的基因間隔區(qū)與質(zhì)粒載體結(jié)合而成的基因載體。,2、基因重組,在體外通過(guò)DNA連接酶的作用，將基因與載體連接在一起形成重組DNA的技術(shù)過(guò)程

14、。黏性末端連接平頭末端連接修飾末端連接,,,,黏性末端,黏性末端,,EcoRI限制酶的切割,,,被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。,,平末端　　　平末端,SmaI限制酶的切割,,當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。,3、形成基因文庫(kù),將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞或包裝成有感染活性的噬菌體的過(guò)程。重組質(zhì)粒載體

15、：轉(zhuǎn)化重組噬菌體DNA載體：需要用噬菌體外殼蛋白將重組DNA進(jìn)行包裝，稱(chēng)為有感染活性的重組噬菌體，而形成基因文庫(kù)。,二、突變基因的篩選,（一）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定（1）提高酶的穩(wěn)定性，高溫篩選重組細(xì)胞，每一次突變－篩選的循環(huán)中逐步提高重組細(xì)胞的培養(yǎng)溫度。（2）如果定向進(jìn)化的目的是提高β－內(nèi)酰胺酶的活性，從而提高對(duì)β－內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素的耐受性，可以通過(guò)在含有一定濃度的β－內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細(xì)胞，并在每一次突變－篩選

16、循環(huán)中逐步提高抗生素的濃度。（二）高通量篩選技術(shù)P217表8－2,1、 平板篩選法,平板篩選法所依據(jù)的重組細(xì)胞的表型包括細(xì)胞生長(zhǎng)情況、顏色變化情況、透明圈情況。1）依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況篩選突變基因在提高酶的熱穩(wěn)定性、抗生素耐受性、pH穩(wěn)定性和對(duì)其他極端環(huán)境條件的耐受能力等方面有廣泛應(yīng)用。,2）依據(jù)顏色變化篩選突變基因,（1）在采用噬菌體DNA載體構(gòu)建突變基因文庫(kù)時(shí)，可以用大腸桿菌β－半乳糖苷酶的基因片斷（lacZ′）插入到噬菌體DNA

17、的間隔區(qū)域中，當(dāng)它感染了相應(yīng)的大腸桿菌宿主細(xì)胞時(shí)，在含有IPTG和底物X－gal的平板培養(yǎng)基上可以形成藍(lán)色噬菌斑。（2）在對(duì)磷酸酯酶進(jìn)行定向進(jìn)化的過(guò)程中，可以在平板培養(yǎng)基中加入硝基酚磷酸，接種重組細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后，有些重組細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)黃色（硝基酚）。,3）依據(jù)透明圈情況篩選突變基因,依據(jù)透明圈情況篩選突變基因是在平板培養(yǎng)基中加入目的酶的作用底物，然后接種重組細(xì)胞，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，在一些重組細(xì)胞的菌落周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)較