磁性納米顆粒定向固定化脂肪酶及其應(yīng)用研究.pdf

1、磁性納米顆粒具有比表面積大、可均勻分散于反應(yīng)體系、表面易修飾為各種不同活性基團(tuán)等優(yōu)點(diǎn),以其為載體固定化的酶在反應(yīng)體系中幾乎不存在傳質(zhì)阻力,且能夠非常容易地在外加磁場(chǎng)作用下分離回收以重復(fù)使用,從而大大降低酶的使用成本。其中磁性納米顆粒共價(jià)交聯(lián)固定化酶穩(wěn)定性最佳。但傳統(tǒng)的共價(jià)固定化載體多隨機(jī)與酶分子上的活性基團(tuán)共價(jià)交聯(lián),這可能導(dǎo)致底物進(jìn)入酶活性位點(diǎn)的通道被阻塞,或形成多位點(diǎn)結(jié)合,更甚者,當(dāng)共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)在酶催化活性中心附近時(shí),會(huì)造成酶活性構(gòu)象

2、發(fā)生不可逆的改變,導(dǎo)致酶活大幅降低。為此,本文通過(guò)生物信息學(xué)分析獲知酶的結(jié)構(gòu)信息,以此為基礎(chǔ),開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便易行的定向固定化方法。針對(duì)不同酶種采用不同固定化體系,并首次使用反膠束固定化體系,獲得了高催化性能的固定化酶。同時(shí)也為其它酶種的定向固定化提供有益借鑒。
　　本文以自制Fe3O4磁性納米顆粒(MNPs)為載體,定向固定化解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)脂肪酶LIP2(YLLIP2)和洋蔥伯克霍爾德菌(Burkh

3、olderiacepacia)脂肪酶(BCL),并進(jìn)行了應(yīng)用探索,主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果摘要如下:
　　1.通過(guò)化學(xué)共沉淀法了制備了MNPs,并以(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)包覆其表面,得到帶-NH2功能化的A-MNPs。采用XRD和FT-IR對(duì)其進(jìn)行表征,XRD圖譜證實(shí)所得磁性納米顆粒為Fe3O4MNPs,且Fe3O4晶相呈現(xiàn)出反尖晶石型,不含其它雜相,說(shuō)明制備的磁性納米晶純度極高。FT-IR檢測(cè)結(jié)果表明,APTES成功

4、實(shí)現(xiàn)了對(duì)MNPs的包覆。所制備的磁性納米顆粒MNPs、A-MNPs粒徑分別為17.2nm和18.4nm。
　　2.通過(guò)分析YLLIP2和BCL一級(jí)結(jié)構(gòu),獲知了兩種酶蛋白的氨基酸組成及帶不同活性基團(tuán)的氨基酸殘基含量。運(yùn)用Rasmol軟件進(jìn)一步分析了兩種酶的三維構(gòu)象,研究酶蛋白中的游離ε-NH2、-COOH、-OH、-SH在其分子上的分布。結(jié)果顯示,兩種酶的游離ε-NH2在酶分子上呈現(xiàn)區(qū)域化分布,距離酶的催化活性中心均較遠(yuǎn),而其它活性

5、基團(tuán)則相對(duì)均一地分布在酶分子上。為此,選擇游離氨基作為共價(jià)固定結(jié)合點(diǎn),以定向固定化YLLIP2和BCL。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合固定化載體性質(zhì),擬定了分別通過(guò)酶蛋白上的游離ε-NH2和-COOH為共價(jià)結(jié)合點(diǎn)的兩種不同固定化策略,實(shí)現(xiàn)酶的固定化。結(jié)果表明:YLLIP2通過(guò)酶上游離氨基和羧基固定化,固定化酶蛋白比活力分別為游離酶的36.9％、17.3%;而B(niǎo)CL通過(guò)酶上游離氨基和羧基固定化,固定化酶蛋白比活力分別為游離酶的128.2%和94.6%。

6、驗(yàn)證了生物信息學(xué)分析的結(jié)論。
　　3.確定以游離氨基為共價(jià)固定結(jié)合點(diǎn)后,以醛基活化的A-MNPs(G-MNPs)為載體,在水相中共價(jià)固定化YLLIP2和BCL,并對(duì)其固定化條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化。結(jié)果表明,兩種酶在水相固定化體系中,固定化率均較高,可達(dá)85%以上。在最優(yōu)條件下,水相固定化YLLIP2的水解酶活回收率為42.4%;而B(niǎo)CL在固定化體系中存在甘油酯作為激活劑和保護(hù)劑的條件下,固定化酶活力得到大幅度提高,其酯化酶活回收率高

7、達(dá)1081.9%。
　　4.以G-MNPs為固定化載體,首次在反膠束固定化體系中實(shí)現(xiàn)了對(duì)YLLIP2和BCL的定向共價(jià)固定化。YLLIP2在Span20反膠束體系中定向固定化后,水解酶活回收率可達(dá)540.2%。優(yōu)化條件為表面活性劑Span20,W0=1.12,正己醇為助表面活性劑且Z=2.26時(shí),酶活回收率進(jìn)一步提高到1466.1%。同樣,BCL在AOT反膠束固定化體系,W0=10,正丁醇為助表面活性劑且Z=2時(shí),其酯化酶活回收率

8、可達(dá)989.5%。
　　5.研究了固定化YLLIP2和BCL的酶學(xué)性質(zhì)。固定化YLLIP2的最適溫度為30℃,較游離酶提高5℃,最適pH為8.0,與游離酶保持一致;其溫度穩(wěn)定性有了大幅提高,40℃下孵育1小時(shí),固定化YLLIP2的殘余酶活保留61.8%,而游離YLLIP2僅為34.3%;pH穩(wěn)定性也得到大幅增強(qiáng),pH7.5下孵育1小時(shí),固定化YLLIP2殘余活力為81.5%,而游離YLLIP2僅有36.4%。固定化BCL的最適溫度

9、為45℃,比游離BCL提高5℃,最適pH為7.0,與游離酶一致;其溫度穩(wěn)定性提高顯著,65℃下孵育1小時(shí),固定化BCL的殘余活力高達(dá)82.4%,而游離BCL的僅為28.9%;其pH穩(wěn)定性在游離酶擁有的良好耐受性的基礎(chǔ)上又有所提高。
　　6.以固定化YLLIP2為催化劑,催化魚(yú)油水解以富集DHA制備功能性油脂。結(jié)果表明,反應(yīng)12h,其水解度及DHA含量達(dá)到40.2%和36.8%,相對(duì)的游離酶水解度和DHA僅為27.3%和31.6%。