2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、脂肪酶(E.C.3.1.1.3)亦稱?;视退饷?,在糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、化學工業(yè)、農(nóng)業(yè)等許多領(lǐng)域有廣泛應用。其中米黑霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase,RML,基因編號:A34959)是一種能夠?qū)R恍运飧视腿?,3位酯鍵的脂肪酶,水解得到的二酯和單酯在工業(yè)中具有更廣泛的應用價值。
   天然的RML包括24個氨基酸組成的信號肽,70個氨基酸組成的前導肽,以及269個氨基酸組成的成熟蛋白。成熟蛋白的理

2、論相對分子質(zhì)量為31.6 kD。本課題的研究對象僅包括前導肽和成熟區(qū)。研究首次利用大腸桿菌原核表達體系對目的基因進行高效表達。通過3種方式提高了RML在大腸桿菌中可溶性蛋白的表達量:1.低溫誘導(16℃)RML表達;2.新型分子伴侶(Skp)與RMLN端融合表達;3.載體pET32a上的Trx· tag與RMLN端融合表達。研究證明低溫誘導RML的表達效果最好,蛋白表達量是37℃誘導結(jié)果的5.4倍,說明誘導溫度是影響可溶性蛋白表達量的關(guān)

3、鍵因素。
   前導肽是一類能夠幫助其相連蛋白正確折疊的多肽,課題首次發(fā)現(xiàn)RML在大腸桿菌體內(nèi)表達后,其前導肽不被切去。而若在克隆過程中人為去掉前導肽序列后,RML在大腸桿菌體內(nèi)沒有表達。這一現(xiàn)象說明RML的前導肽對其成熟蛋白的正確折疊具有重要作用,并指出在后續(xù)對RML進行改造的研究中應以包括前導肽的RML全蛋白為研究對象。
   提高脂肪酶的催化比活力,是降低脂肪酶生產(chǎn)成本的有效途徑之一。研究在RML全蛋白結(jié)構(gòu)未知的前

4、提下,首先采取易錯PCR方式引入隨機突變,再通過有效的高通量篩選方法挑出理想的突變體;其次,通過對RML前導肽與成熟區(qū)域折疊方式的正確分析,得出RML成熟區(qū)域是相對于前導肽獨立折疊的結(jié)論,其空間結(jié)構(gòu)(PDB:3TGL)可作為蛋白改造的參考依據(jù);最后,參考RML成熟蛋白結(jié)構(gòu),對易錯PCR得到的突變位點進行篩選,再通過定點突變和飽和突變持續(xù)提高RML的活性和耐熱性。據(jù)此,研究充分利用定向進化的各種策略對酶進行成功的改造,共包括4輪易錯PCR

5、、2次定點突變和4輪飽和突變。不僅使RML水解甘油三酯的活性得到明顯提高,還使其耐熱性得到改良。研究共挑選出15株理想突變體,其中M13(D48V/V67A/S168P/S240V/S311 C/D313H)的比活可達到3609±100U/mg,為野生型RML水解活性的14.3倍;而M15(D48V/V67A/S168P/S240A/S311C/D313H)具有最理想耐熱性,其經(jīng)70℃兩小時熱處理后,保留活性達1316±50U/mg,而

6、這一數(shù)值是野生型RML不經(jīng)熱處理水解活性的5.2倍。高活性和高耐熱性的酶對于工業(yè)的應用更為廣泛。因此,在利用定向進化技術(shù)對酶進行改造的設(shè)計中,不能僅局限于一種方式,而多角度結(jié)合,利用“半理性設(shè)計”思想才會有更好的效果。
   本課題還首次研究了前導肽在脂肪酶定向進化中的作用。盡管前導肽的作用被普遍認為是幫助其相連蛋白的正確折疊,RML的前導肽和成熟蛋白在空間構(gòu)象上也是相互獨立折疊的兩部分,然而RML定向進化結(jié)果仍有力指出前導肽的

7、突變提高了目的蛋白的水解活性。通過對源于脂肪酶家族23段前導肽序列的二級結(jié)構(gòu)比對分析,發(fā)現(xiàn)前導肽的N末端和C末端多以疏水性氨基酸為主,并且RML前導肽的突變也多集中于N末端或C末端,并趨向于疏水性氨基酸的突變。這一結(jié)果顯示:RML前導肽的突變向著有利于其自身折疊過程中形成“穩(wěn)定內(nèi)核”的方向發(fā)展,這有利于幫助RML成熟區(qū)更“完美”的折疊,進而影響其比活。因此,高活性的突變體是在RML前導肽和成熟區(qū)的協(xié)同作用下,共同進化的結(jié)果。前導肽的進化

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