24815.幾丁質(zhì)酶的體外定向進(jìn)化研究

1、DissertationSubmittedtoZhejiangGongshangUniversityforMaster’SDegreeofEngineeringDIRECTEVOLUTl0N0FENDOCHITINASEAuthor：MinXuMajor：BiochemicalEngineeringSupervisor：PingYuervlsor：uJan201lCollegeofFoodScienceandBiotechnologyE

2、ngineering，ZhejiangGongshangUniversityHangzhou，310012，ERChina幾丁質(zhì)酶的體外定向進(jìn)化研究1862736㈣腳腳朋刪伽㈣摘要幾丁質(zhì)是由N乙酰氨基葡萄糖(Nacetylglucosamine，GlcNAc)通過(guò)p一1，4糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，是僅次于纖維素的第二大可再生資源。幾丁質(zhì)的中間降解產(chǎn)物幾丁寡糖是一種具有獨(dú)特生理活性的功能性低聚糖，分子量小、溶解性好、易于吸收的特性使

3、其在生物醫(yī)藥、食品、化妝品、紡織、農(nóng)業(yè)等各領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。與國(guó)外相比，我國(guó)對(duì)幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)得到幾丁寡糖的研究起步較晚，且其酶活力不高，不能滿(mǎn)足產(chǎn)業(yè)化要求，因此提高幾丁質(zhì)酶的水解活力具有非常大的意義。本課題組己完成了以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)克隆表達(dá)綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的工作。本課題以該基因作為起始材料，通過(guò)定向進(jìn)化策略和高通量篩選手段提高了內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的活力；對(duì)高活力突變株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)重組蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化并研究其酶

4、學(xué)性質(zhì)。主要研究結(jié)果如下所述：利用易錯(cuò)PCR技術(shù)，以重組質(zhì)粒pET28a()MECH。為模板構(gòu)建突變體庫(kù)，用于高通量篩選。從原始菌株BL21／pET28a()一MECH。出發(fā)經(jīng)過(guò)一輪定向進(jìn)化，篩選得到突變菌株MECHl8，其酶活是原始菌株的181倍。測(cè)序結(jié)果表明，目的基因有9個(gè)堿基發(fā)生了突變：G69A，T276C，C300T，A554T，T676C，A1002G，T1168A，A1169G，G1170C。由此導(dǎo)致氨基酸序列第185位酪氨