2-氯丙酸脫鹵酶的定向進化.pdf

1、2-氯丙酸是一種重要的化工中間體，被廣泛應用于醫(yī)藥、染料、農藥等行業(yè)。使用2-氯丙酸脫鹵酶制備光學純2-氯丙酸的有重要的意義。
　　 本文首先通過易錯PCR手段將S-2-氯丙酸脫鹵酶定向進化，并篩選得到進化酶Deh(Ⅱ)-B2，該酶的最適pH為9.5，最適溫度為60℃，Vmax和Km的值分別為2.63×10-3 mM·min-1和0.75 mM。進化酶的比活比原始酶提高了3.9倍。通過分子模擬和分子對接發(fā)現(xiàn)，Deh(Ⅱ)-B2的

2、活化能下降了1.4 kcal/mol，催化殘基Asp10與底物α碳原子的距離縮短了0.3216 nm。在兩者的綜合作用下使酶活力提高。
　　 其次，通過定點突變改造R-2-氯丙酸脫鹵酶的Asn203位點。發(fā)現(xiàn)當該位點突變?yōu)镾er203時，酶的選擇性由催化R-2-氯丙酸轉化為催化S-2-氯丙酸，比活降到0.101U/mg;當該位點突變?yōu)镚ln203時，酶的選擇性未變，但是比活降低了17％。突變?yōu)槠渌被峋Щ?。同源建模結果表明空

3、間位阻效應和氫鍵作用可以很好的解釋各種突變體的比活變化。
　　 最后，通過易錯PCR手段將R-2-氯丙酸脫鹵酶定向進化，并篩選得到有效突變子庫，突變子DehD(Ⅳ)-G2和DehD(Ⅳ)-E7的酶活力分別提高24.8％和39.6％。通過SYBYL對酶與底物進行分子對接顯示，DehD(Ⅳ)-G2的活化能下降0.23kcal/mol，DehD(Ⅳ)-E7的活化能下降0.61 kcal/mol。由于酶和底物R-2-氯丙酸的活化能下降，