大、小鼠來(lái)源日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因的差異表達(dá)分析及Sjcaspase3-7的克隆、真核表達(dá)和生物學(xué)功能分析.pdf

1、日本血吸蟲病是一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病，仍是我國(guó)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。截止到2013年底，我國(guó)仍推算有血吸蟲病人18多萬(wàn)例。至今，仍沒(méi)有理想的血吸蟲病疫苗可在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，血吸蟲病防治仍主要依靠大規(guī)模的吡喹酮化療，且已有血吸蟲對(duì)吡喹酮產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道。因此，迫切需要篩選治療血吸蟲病新藥物。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種主要方式，日本血吸蟲細(xì)胞凋亡的研究可為日本血吸蟲新藥靶的篩選提供新思路。
　　本研究通過(guò)對(duì)日本血吸蟲全基因組信

2、息挖掘，鑒定了15個(gè)日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因。通過(guò)RT-PCR技術(shù)分析了這些凋亡相關(guān)基因在適宜性宿主BALB/c小鼠和非適宜性宿主Wistar大鼠來(lái)源的不同時(shí)期的日本血吸蟲中的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)差異，對(duì)其中重要的差異表達(dá)基因 Sjcaspase3/7進(jìn)行了克隆、真核表達(dá)及生物學(xué)功能分析，為深入研究日本血吸蟲凋亡機(jī)制和新藥靶的鑒定奠定了基礎(chǔ)。
　　1.大、小鼠來(lái)源日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因的表達(dá)分析
　　分別收集了BALB/c小鼠和Wi

3、star大鼠來(lái)源14d,23d,32d,42d四個(gè)時(shí)期共八組日本血吸蟲蟲體，利用Trizol提取蟲體的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用日本血吸蟲全基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，共獲得了15個(gè)與日本血吸蟲細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因。通過(guò)RT-PCR分析了這15個(gè)凋亡相關(guān)基因在不同宿主和不同期別的表達(dá)情況。初步分析結(jié)果表明兩種宿主來(lái)源的日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況存在差別，其中早期（14d）蟲體中凋亡基因表達(dá)差異較小，但自23d起，大鼠來(lái)源蟲

4、體中凋亡相關(guān)基因高表達(dá)數(shù)量明顯高于小鼠來(lái)源蟲體，這可能是影響日本血吸蟲在非適宜性宿主大鼠體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一。進(jìn)一步分析表明日本血吸蟲至少存在一條完整但相對(duì)簡(jiǎn)單的內(nèi)源性凋亡通路（線粒體通路）。本研究為深入研究日本血吸蟲與宿主的相互作用機(jī)制和日本血吸蟲的凋亡機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　2.日本血吸蟲Sjcaspase7的克隆、真核表達(dá)及生物學(xué)功能分析
　　本研究對(duì)日本血吸蟲凋亡基因 Sjcaspase7進(jìn)行了克隆并成功構(gòu)建了真

5、核表達(dá)質(zhì)粒 pXJ40-FLAG-Sjcaspase7。IFA結(jié)果顯示Sjcaspase7成功在Hela細(xì)胞中表達(dá)。Western Blotting結(jié)果分析表明重組蛋白Sjcaspase7分子量約為36KDa。Caspase酶活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rSjcaspase7重組蛋白具有切割底物DEVD的活性，同時(shí)該活性可以被抑制劑Z-DEVD-FMK所抑制。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明Sjcaspase7可誘導(dǎo)Hela發(fā)生早期細(xì)胞凋亡。通過(guò)體外RNA

6、干擾篩選首先得到一組對(duì)Sjcaspase7干擾效果明顯的小干擾 RNA(SiRNA-883)。體內(nèi)干擾實(shí)驗(yàn)也證明了 SiRNA-883對(duì)日本血吸蟲Sjcaspase7的表達(dá)具有一定的干擾效果。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，蟲體Sjcaspase7基因下調(diào)表達(dá)了32.59％；干擾組蟲荷數(shù)和肝臟蟲卵數(shù)分別下降了30.77%和28.85%。同時(shí)，對(duì)各組蟲體Caspase酶活檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干擾組酶活比對(duì)照組下降了89.73%，結(jié)果表明Sjcaspa

7、se7對(duì)日本血吸蟲的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)卵可能具有重要作用。本研究為深入研究日本血吸蟲凋亡基因Sjcaspase7的生物學(xué)功能及日本血吸蟲的凋亡機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。
　　3.日本血吸蟲Sjcaspase3的克隆、真核表達(dá)及生物學(xué)功能分析
　　利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得Sjcaspase3基因的編碼序列，其ORF含900bp，編碼299個(gè)氨基酸，理論分子量為33509.7Da，理論等電點(diǎn)為6.39。Real-time PCR分析表明該基因

8、在檢測(cè)的各階段日本血吸蟲中普遍表達(dá)，其中21d表達(dá)量最高，42d雌蟲表達(dá)量高于42d雄蟲。成功構(gòu)建了pXJ40-FLAG-Sjcaspase3重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染到 Hela細(xì)胞內(nèi)，熒光定量 PCR和 Western Blotting分析表明Sjcaspase3成功在Hela細(xì)胞中表達(dá)。酶活實(shí)驗(yàn)提示重組rSjcaspase3蛋白具有切割特異性底物天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸（DEVD）的活性。流式細(xì)胞術(shù)分析表明Sjcaspase3可誘導(dǎo)