大豆GmTOCls和GmLCLs的基因克隆、表達模式及功能分析.pdf

1、擬南芥生物鐘系統(tǒng)的中央振蕩器主要有三個重要組分：即CCAI(CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATEDI),LHY(LATE ELONGATEDHYPOCOTYL)和TOCI(TIMING OF CAB EXPRESSIOVI).CCAI瓢LHY各編碼MYB相關的轉錄因子，TOCI是一個偽反應調節(jié)因子(PSEUDO-RESPONSE REGULATOR)。凌晨時，CCA1和LHY的轉錄達到高峰，其蛋白結合在TOCI啟動子的夜晚

2、元件(Evening element，EE)上協(xié)同抑制TOCI的轉錄。而在暗中，TOCI表達逐漸升高并在深夜選到高峰，高表達的TOCI通過一種未知的機制促進CCAI和LHY的表達并使其在凌晨達到高峰，三者形成一個反饋抑制環(huán)(Feedback loop)，并有節(jié)律的振蕩。
　　 大豆是典型的短日植物，又是古四倍體，因此，研究大豆生物鐘成分LHY/CCAI/TOC1，闡明其功能，對揭示大豆光周期調節(jié)及植物生物鐘系統(tǒng)的進化和多樣性具有

3、重要意義。
　　 本研究從大豆KN18中克隆得到的四個TOC1同源物及其啟動子，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，大豆GmTOC1s與AtTOCI位于同一進化枝，表明它們之間的親緣關系較近。從內含子-外顯子比對分析結果可以看出，GmTOC1的四個拷貝與AtTOC1同源性較高；進一步的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)．GmTOC1的四個拷貝及AtTOC1分別有二個外顯子同時編碼保守的調節(jié)區(qū)域，一個外顯子都編碼保守的CCT區(qū)域。由此可見，GmTOCi與At

4、TOC1可能具有相似的功能。
　　 對大豆四個TOC1同源物的啟動子進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)四個啟動子都具有受光誘導、激素誘導和脅迫誘導等順式作用元件，而且和擬南芥AtTOC1啟動于相比較，各類元件又具有各自的特異性；分析EE元件，發(fā)現(xiàn)在擬南芥AtTOC1和大豆GmTOC1-3的啟動子中都具有完整的夜晚元件AAAATATCT，在大豆TOC1同源物的其他啟動子中不具有完整的EE元件，但含有AAAATATNN元件，初步推測可能在進化

5、過程中發(fā)生了EE元件后兩個堿基的突變，但并不影響其正常功能。
　　 本研究還克隆到大豆GmLCL(Glycine max L．LHY and CCA1 Like)基因的四個拷貝，對其進行了生物信息學分析，用實時定量PCR(QuantitativeReal-time RT-PCR)分析丁其在不同組織器官和發(fā)育時期的時空表達模式，并將部分基因在擬南芥中過表達研究其功能。．主要研究結果如下：
　　 1．大豆GmLCLs基因均具

6、有保守的MYB DNA結合域，在MYB DNA結合域上游都具有保守的絲氨酸位點;
　　 2．GmLCL1，GmLCL2，GmLCL3和GmLCL4 mRNA表達，除開花期外，大多在其他發(fā)育時期的葉片中高水平表達，初步推測GmLCLs在大豆發(fā)育的前期和中期具有重要功能；
　　 3．分析大豆GmLCLs總蛋白在不同發(fā)育時期和不同組織器官的表達模式，發(fā)現(xiàn)具有與mRNA對應的表達模式；
　　 4．長日條件下，不同緯度來源