粘蟲(chóng)生物鐘基因的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、粘蟲(chóng)Mythimna separata(Walker)隸屬鱗翅目夜蛾科，是一種典型的季節(jié)性遠(yuǎn)距離遷飛害蟲(chóng)，也是嚴(yán)重威脅我國(guó)糧食作物生產(chǎn)安全的重大害蟲(chóng)，廣泛分布于亞洲和澳洲的多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。粘蟲(chóng)在我國(guó)每年南北往返遷飛危害。近年來(lái)，由于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)變化，粘蟲(chóng)的發(fā)生危害呈現(xiàn)加重趨勢(shì)，尤其是2012和2013年在全國(guó)范圍暴發(fā)成災(zāi)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響。生物鐘基因是調(diào)控生物節(jié)律的一類基因，在細(xì)胞、組織、器官和行為等各層次中起作用。而粘蟲(chóng)作為

2、一種晝伏夜出性害蟲(chóng)，其飛行、交配、產(chǎn)卵等行為均發(fā)生于夜晚，具有明顯的晝夜節(jié)律。但截至目前，有關(guān)其晝夜活動(dòng)節(jié)律的分子調(diào)控機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　本研究首次對(duì)粘蟲(chóng)4個(gè)生物鐘基因進(jìn)行了克隆，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了相應(yīng)的表達(dá)模式，并就生物鐘基因?qū)φ诚x(chóng)活動(dòng)節(jié)律的調(diào)控進(jìn)行了進(jìn)一步研究。取得如下主要研究結(jié)果。
　　1.根據(jù)粘蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)擴(kuò)增獲得4種粘蟲(chóng)生物鐘基因period、timless、clock和cycle，分

3、別命名為Msper(KY446805)、Mstim(KY446806)、Msclk(KY446807)、Mscyc(KY825136)，長(zhǎng)度分別為3579 bp、3132 bp、1851 bp、2094 bp，分別編碼1192、1043、616、697個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量分別為132 kDa、117kDa、69 kDa、75 kDa，理論等電點(diǎn)分別為6.50、5.14、5.63、6.74。經(jīng)序列比對(duì)，MsPER與一點(diǎn)粘蟲(chóng)Mythim

4、naunipuncta、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、芹菜夜蛾Anagrapha falcifera等夜蛾科昆蟲(chóng)PER序列一致性達(dá)83％以上;MsTIM與棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera、甜菜夜蛾、蛀莖夜蛾Sesamia nonagrioides等昆蟲(chóng)TIM序列一致性達(dá)80％以上;MsCLK與甜菜夜蛾、棉鈴蟲(chóng)CLK序列一致性達(dá)90％以上;MsCYC與蛀莖夜蛾，家蠶Bombyx mori、小菜蛾plutella

5、xylostella、柞蠶Antheraea pernyi等CYC序列一致性達(dá)68％以上。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果與氨基酸序列比對(duì)結(jié)果基本一致。
　　2.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了粘蟲(chóng)生物鐘基因Msper、Mstim、Mscyc和Msclk的時(shí)空表達(dá)模式:
　　(1)4個(gè)生物鐘基因的mRNA在粘蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量差異顯著，成蟲(chóng)期表達(dá)量顯著高于其他發(fā)育階段。除Mscyc基因在1齡幼蟲(chóng)期表達(dá)量高于卵期外，其他基因均為幼蟲(chóng)期表達(dá)量

6、最低。
　　(2)成蟲(chóng)不同組織生物鐘基因的表達(dá)量不同。Msper、Mstim、Mscyc在觸角中表達(dá)量最高，其次為頭部，而Msclk在頭部的表達(dá)量顯著高于觸角。在飛行肌、足及生殖腺中，上述4種基因的表達(dá)量無(wú)明顯的規(guī)律性。
　　(3)4個(gè)生物鐘基因的相對(duì)表達(dá)量均具有晝夜節(jié)律變化，其中Msper、Mstim與Msclk在雌、雄成蟲(chóng)中均表現(xiàn)為光期表達(dá)量較低，暗期表達(dá)量較高;而Mscyc在光期起始時(shí)表達(dá)量最高，暗期末表達(dá)量最低。

7、r>　　3.采用顯微注射法對(duì)Msper基因進(jìn)行干擾，并測(cè)定其活動(dòng)節(jié)律變化。結(jié)果表明干擾24 h后Msper表達(dá)量下降60％，受干擾后粘蟲(chóng)在夜晚無(wú)高飛行強(qiáng)度;而對(duì)照試蟲(chóng)在暗期末期出現(xiàn)一個(gè)高飛行強(qiáng)度。且受干擾的個(gè)體在沉默試劑生效的48 h內(nèi)無(wú)產(chǎn)卵現(xiàn)象，試劑失效后產(chǎn)卵行為恢復(fù)。
　　本研究首次克隆得到4個(gè)粘蟲(chóng)生物鐘基因，并明確了Msper、Mstim、Mscyc和Msclk在粘蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期、成蟲(chóng)不同組織中的晝夜表達(dá)規(guī)律，且證明Mspe