日本血吸蟲生殖相關(guān)基因SjWD40的克隆表達(dá)及其免疫學(xué)特性研究.pdf

1、目的：將在細(xì)胞的運動、生長、發(fā)育和信號通路等多個方面發(fā)揮重要作用的WD40蛋白家族作為研究的對象，從GenBank中現(xiàn)有的日本血吸蟲基因數(shù)據(jù)庫中篩選了功能尚未證實的WD40蛋白家族成員SjWD40，對該基因的結(jié)構(gòu)和功能進行生物信息學(xué)預(yù)測，并通過基因工程的方法獲得重組蛋白，制備特異性抗體，對該基因在血吸蟲不同階段的表達(dá)和組織定位進行研究，確定它在蟲體哪個組織器官中表達(dá)，初步推測它主要在哪方面發(fā)揮生物學(xué)功能，并評價該重組蛋白是否具有免疫學(xué)價

2、值。 方法：SjWD40基因的生物信息學(xué)分析；SjWD40基因的克隆、表達(dá)及免疫學(xué)特性分析；SjWD40在蟲體的各個階段和組織中表達(dá)的研究。 結(jié)果：①SjWD40基因的生物信息學(xué)分析。Blastx分析該基因具有完整的開放閱讀框，基因全長1086bp，編碼區(qū)為66-950，起始密碼為ATG，終止密碼為TAA，編碼294個氨基酸，理論分子量和等電點分別是31.8kDa和6.44。PredictProtein預(yù)測該序列二級結(jié)構(gòu)

3、中α螺旋(H)、β折疊(E)和無規(guī)則卷曲(L)的比例分別是0:55.78:44.22。Motifscan預(yù)測該蛋白含有一個可能的糖基化位點，1個CAMP磷酸化位點，3個潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點，2個潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點，1個酪氨酸激酶磷酸化位點，9個潛在的N—肉豆蔻酰位點。InterProScan顯示該蛋白含有6個WD40結(jié)構(gòu)域，推測其可能是WD40蛋白家族中的一員，參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能，如信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)

4、節(jié)、細(xì)胞增殖等方面起到重要的作用。②SjWD40基因的克隆、表達(dá)及免疫學(xué)特性分析。設(shè)計引物從日本血吸蟲cDNA中擴增SjWD40目的片段，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA條帶在885bp左右，定向克隆獲得的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET—28a(+)—SjWD40經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定后證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)重組蛋白，經(jīng)SDS—PAGE顯示與理論預(yù)測的融合蛋白分子量相符，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)變性、親和層析純化，獲得日的蛋白。③S

5、jWD40在蟲體的各個階段和組織中表達(dá)的研究。提取日本血吸蟲雌蟲、雄蟲、蟲卵、尾蚴的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA，采用RT—PCR對SjWD40編碼基因在不同蟲期的相對表達(dá)水平進行分析。實驗結(jié)果顯示，SjWD40基因在不同發(fā)育期均有轉(zhuǎn)錄，且轉(zhuǎn)錄水平無明顯差異。 結(jié)論：⑴從GenBank中現(xiàn)有的日本血吸蟲基因數(shù)據(jù)庫中篩選了功能尚未證實的WD40蛋白家族成員SjWD40，該蛋白含有6個WD40結(jié)構(gòu)域，屬于WD蛋白家族中的一員，

6、利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了pET—28a(+)—SjWD40原核表達(dá)載體，得到純化的重組蛋白。⑵Western Blotting結(jié)果表明該重組蛋白具有較強的免疫原性和免疫反應(yīng)性。應(yīng)用ELISA方法，比較重組抗原和成蟲粗抗原檢測日本血吸蟲病人血清IgG敏感性表明，該重組蛋白與粗制的SjAWA具有相似的敏感性、特異性和交叉反應(yīng)性，提示rSjWD40抗原可以用作日本血吸蟲病的診斷抗原。⑶SjWD40在日本血吸蟲生活史各時期均有表達(dá)，定位于日本