日本血吸蟲性相關(guān)Tsunagi基因的克隆、表達(dá)及初步鑒定.pdf

1、血吸蟲病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病。血吸蟲致病主要是由于性成熟雌蟲所產(chǎn)蟲卵在人畜肝臟大量沉積形成的蟲卵肉芽腫和纖維化，而沉積在腸壁的蟲卵排出體外是該病流行傳播的重要途徑。另一方面，血吸蟲雌雄合抱是雌蟲生殖系統(tǒng)正常發(fā)育和產(chǎn)卵的前提條件，雌蟲的發(fā)育成熟又是雄蟲依賴性的。因此，控制血吸蟲性別分化、性成熟及雌蟲產(chǎn)卵成為防治血吸蟲病的重要策略。 Mago nashi基因在模式生物如果蠅和秀麗隱桿線蟲中是調(diào)節(jié)雌雄同體性別決定

2、基因即決定生殖細(xì)胞雄性化作用的基因，該基因的蛋自產(chǎn)物與Tsunagi(或Y14)蛋白結(jié)合成復(fù)合物共同行使功能。已有實(shí)驗(yàn)報(bào)道這兩種蛋白在進(jìn)化過程中均高度保守表達(dá)。本課題組在前期工作中已經(jīng)用RNAi方法研究了日本血吸蟲Mago nashi基因(登錄號(hào)BM735619)干擾后血吸蟲的表型變化，發(fā)現(xiàn)部分實(shí)驗(yàn)組雄蟲睪丸小葉中的精母細(xì)胞表現(xiàn)出泛雄性化表型。但是日本血吸蟲Tsunagi基因至今未有報(bào)導(dǎo)，本文旨在獲得日本血吸蟲Tsunagi基因序列并對(duì)

3、該基因的功能進(jìn)行初步鑒定。 根據(jù)遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，本文利用黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲Tsunagi蛋白高度保守的60個(gè)氨基酸序列，使用blastp，blockmarker，CodeHop等網(wǎng)絡(luò)工具及數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，從日本血吸蟲成蟲cDNA中擴(kuò)增出了一段長(zhǎng)180bp的PCR產(chǎn)物，測(cè)序后經(jīng)blastx檢索GenBank，發(fā)現(xiàn)這段基因的氨基酸序列與黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲Tsunagi蛋白的氨基酸序列高度同源。然后利用5'端和3'端

4、錨定PCR方法分別從日本血吸蟲童蟲cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出日本血吸蟲Tsunagi蛋白基因上、下游的未知序列。再根據(jù)錨定PCR產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，并在引物5'端分別引入BamI和XhoI酶切位點(diǎn)，從日本血吸蟲童蟲cDNA文庫(kù)和日本血吸蟲成蟲cDNA中均擴(kuò)增出了日本血吸蟲Tsunagi基因的開放閱讀框(Open readingframe，ORF)。經(jīng)基因測(cè)序分析后該cDNA長(zhǎng)度為531bp，編碼177個(gè)氨基酸，蛋白的理論分子量為20.

5、078 KD，等電點(diǎn)為6.195。SjTsunagi基因同源性比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸序列與其它物種的Tsunagi蛋白有很高的相似性：與黑腹果蠅Tsunagi蛋自的氨基酸序列有55.9％的同源性和67.2％的相似性；與秀麗隱桿線蟲Tsunagi蛋白的氨基酸序列有40.6％的同源性和51.4％的相似性。蛋白功能分析預(yù)測(cè)該蛋自含有一個(gè)保守的RNA識(shí)別模序，理論上是RNA結(jié)合蛋白。將獲得的日本血吸蟲Tsunagi基因的完整ORF亞克隆入原核

6、表達(dá)載體pET28a(+)中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-SjTsunagi在大腸桿菌中獲得了可溶性表達(dá)。用純化后的融合蛋白免疫小鼠，經(jīng)ELISA鑒定獲得的多克隆抗體效價(jià)為1:51200，免疫印跡證實(shí)抗體可特異性識(shí)別目的蛋白。為了觀察天然Tsunagi蛋白在日本血吸蟲體內(nèi)的定位，我們首先制備了日本血吸蟲成蟲HE染色切片，掌握了日本血吸蟲成蟲在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)特點(diǎn)后，用間接免疫熒光法觀察到日本血吸蟲Tsunagi蛋白僅在雌蟲卵巢的卵母細(xì)

7、胞內(nèi)高表達(dá)。利用免疫印跡觀察SjTsunagi蛋白在蟲卵、雌蟲、雄蟲和混合成蟲等不同階段的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白也僅在雌蟲階段表達(dá)，提示Tsunagi蛋白可能是血吸蟲的性別相關(guān)基因。利用Pull-down和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了日本血吸蟲Tsunagi和Mago nashi蛋白的相互作用關(guān)系。 本論文率先開展了血吸蟲Tsunagi基因的研究，首次獲得編碼Tsunagi蛋白的基因，成功將Tsunagi基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)并獲