日本血吸蟲信號轉導蛋白SjWnt4、SjWnt10a編碼基因的克隆、表達及其生物學功能分析.pdf

1、血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的分布廣泛、危害嚴重的人獸共患寄生蟲病.血吸蟲不同發(fā)育階段蟲體呈現(xiàn)不同的基因差異表達模式,導致血吸蟲獨特的代謝和發(fā)育過程及顯著的生物學和形態(tài)學變化.由Wnt基因家族產物與其它相關基因產物所構成的Wnt信號通路,是細胞發(fā)育和生長調節(jié)的一個關鍵途徑,對動物的發(fā)育起著重要的調節(jié)作用.本研究在日本血吸蟲性別、期別差異蛋白質組研究的基礎上,首次克隆了2個編碼信號轉導蛋白Wnt的基因,并對這兩個基因進行了表達及生物學功能研

2、究. 作者首先利用本實驗室在雙向電泳結合肽質量指紋圖譜分析基礎上獲得的1個Wnt家族蛋白的一段肽序列,以此肽序列為詢問序列在日本血吸蟲EST庫中搜索到2個日本血吸蟲的相應EST片段(GenBank登錄號AAM89872、AY811118).根據(jù)EST序列,利用RACE技術首次克隆獲得日本血吸蟲信號轉導蛋白Wnt4編碼基因研wnt4(GenBank登錄號DQ643829)和Wnt10a編碼基因Sjwnt10a(GenBank登錄號

3、DQ643830). 生物信息學分析表明這兩個基因編碼的蛋白質具有十分典型的Wnt家族蛋白特征:整個蛋白序列中散在著100多個Wnt家族蛋白的保守位點;有23～24個可交連形成二硫鍵的保守的半胱氨酸殘基,其中50﹪位于蛋白的羧基端;具有三個或四個糖基化位點.序列分析表明研wnt4基因的ORF含1311bp,編碼436個氨基酸,理論分子量49.6kD,該基因編碼的氨基酸序列與日本三角渦蟲的Wnt4相似性達43﹪,與人Wnt4的相似

4、性為37﹪.實時定量PCR分析顯示該基因在14天童蟲、19天童蟲、31天成蟲、44天雌蟲及44天雄蟲中均有表達,其中19天童蟲中的表達量明顯高于其它發(fā)育階段,44天雌蟲中的表達量明顯高于雄蟲.成功構建了該基因的重組表達質粒pGEX-4T-2-Sjwnt4,應用大腸桿菌系統(tǒng)進行了表達,重組蛋白以包涵體形式存在,分子量為76kD,Westem blotting顯示表達產物能被日本血吸蟲成蟲抗原免疫兔血清所識別,具有良好的抗原性.Sjwnt1

5、0a基因的ORF含1896bp,編碼631個氨基酸,理論分子量73.3kD.該基因編碼的氨基酸序列與人、鼠的Wnt10a的氨基酸序列相似性都為26﹪.實時定量PCR分析顯示該基因在日本血吸蟲19天童蟲中表達量最高,在14天童蟲和44天雄蟲中也有表達,但分別僅為19天童蟲表達量的8.8﹪和5﹪,而在31天成蟲和44天雌蟲中沒有檢測到該基因. 本文利用RNAi技術對Sjwnt4基因表達進行了初步地探索,成功篩選出具有較高干擾效果的s

6、iRNA小分子S499,抑制率達到86.4﹪,為后續(xù)試驗打下基礎.應用重組蛋白rsjWnt4.免疫BALB/c小鼠,獲得了19.90﹪的減蟲率和20.58﹪的肝組織減卵率. 本論文率先開展了血吸蟲信號轉導蛋白Wnt的研究,首次獲得兩個編碼信號轉導蛋白Wnt的基因,發(fā)現(xiàn)這兩個基因在童蟲期高表達;成功將Sjwnt4在大腸桿菌中進行了表達,在小鼠中初步評估了重組蛋白誘導的免疫保護效果;成功篩選出對Sjwnt4基因具有干擾作用的siRN