牛外周血中單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞及其TLRs家族基因的相關(guān)研究.pdf

1、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在抵抗和防御病原體感染中發(fā)揮了重要作用，尤其是在細(xì)胞內(nèi)的病原體防御中發(fā)揮了巨大作用。根據(jù)組織內(nèi)環(huán)境以及它們自身所處的不同分化階段，它們都表現(xiàn)出不同的形態(tài)、機(jī)能和代謝作用。這些細(xì)胞可以通過細(xì)胞表面表達(dá)的TLR來識(shí)別和結(jié)合PAMP引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)通路從而激發(fā)宿主的防御系統(tǒng)。至今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了TLR1-TLR10的部分基因序列，然而對(duì)牛外周血單核細(xì)胞及其巨噬細(xì)胞中Toll樣受體的表達(dá)形式還不清除。因此本試驗(yàn)采取單核細(xì)胞以及由來

2、巨噬細(xì)胞進(jìn)行研究，主要研究牛外周血中此類細(xì)胞Toll樣受體的表達(dá)形式，及其在LPS刺激條件下細(xì)胞因子的表達(dá)，從而得知該細(xì)胞在宿主免疫中發(fā)揮的重要作用。 試驗(yàn)一：牛外周血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)和純化方法 本試驗(yàn)采用流式細(xì)胞分離儀和磁性細(xì)胞分離儀分離和鑒定了外周血中單核細(xì)胞及其由來的巨噬細(xì)胞，通過使用Repcell細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，改進(jìn)了TaflonBag培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的方法，且單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分離百分率分別為9

3、7.9％和73.9％。從而簡(jiǎn)化的了試驗(yàn)步驟，為以后的試驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 試驗(yàn)二：牛外周血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞Toll樣受體mRNA水平的表達(dá)形式 通過RT-PCR和NIH光密度成像系統(tǒng)分析得到單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞TLRsmRNA的表達(dá)形式，并測(cè)得在LPS刺激時(shí)，TLRs家族中不同TLR對(duì)LPS的反應(yīng)能力。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在LPS刺激24h后，IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，表達(dá)量分別為2.

4、02±0.48和1.66±0.39。與此同時(shí)IL-8 mRNA的表達(dá)量相對(duì)提高，即2.14±0.52。TLR1、TLR3、TLR5、TLR8和TLR10的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物顯著下降(P<0.05)，然而TLR2、TLR4、TLR6和TLR7則保持穩(wěn)定。另外單核細(xì)胞的Toll樣受體1-10以及細(xì)胞因子的表達(dá)量在LPS刺激前后保持穩(wěn)定，其中TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR10的表達(dá)量高于1.0，IL-8和IL-6的表

5、達(dá)量大于TNF-α，它們?cè)贚PS刺激后的表達(dá)量分別為1.384±0.41、1.474±0.17和1.214±0.51，與單核細(xì)胞相似的是TLR9不管是在正常培養(yǎng)條件下還是LPS刺激條件下都沒有表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞在受到病原刺激后通過提高IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)量從而提高了天然免疫的作用。該研究為探討巨噬細(xì)胞在天然免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。 第三章：牛外周血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中Toll樣受體蛋白質(zhì)水平的表達(dá)形式

6、 本試驗(yàn)通過使用熒光免疫染色、流式細(xì)胞分離儀和共聚焦電鏡，分析得知TLR2和TLR4在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面的分布形式以及蛋白水平的表達(dá)量，并研究了在LPS刺激條件下，TLR2和TLR4的變化情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在受到LPS刺激24h后，TLR2和TLR4蛋白水平表達(dá)量相對(duì)提高，分別為34.1％、47.1％和22.4％、10.1％，TLR2和TLR4蛋白水平的表達(dá)量與mRNA水平的表達(dá)形式一致，從而充分證實(shí)了TL