單核細胞增生李斯特菌毒力相關(guān)基因的篩選鑒定及其功能研究.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)于2015年統(tǒng)計結(jié)果顯示，全球每年發(fā)生食源性疾病的病例數(shù)超過60億人次，平均每10個人中就有一例感染，導致42萬人死亡，食源性疾病已成為當今世界重大的公共衛(wèi)生問題。由單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)、沙門菌（Salmonella spp.）和大腸桿菌(Escherichia coli)等病原細菌引起的食源性疾病是影響食品安全的最主要的因素之一。其中Lm引起的李斯特菌病具有

2、高致死率的特點，早在2000年就已被WHO列入重點檢測的食源性致病菌之一。Lm作為兼性胞內(nèi)寄生的革蘭陽性桿菌，在自然環(huán)境中廣泛分布，隨被污染的食物進入腸道后，可引發(fā)胃腸炎、腦膜炎、流產(chǎn)等臨床癥狀。深入研究Lm的致病機理，獲得與致病性相關(guān)的毒力因子和分子標識，對李斯特菌病的預防控制具有重要的意義。
　　Lm體內(nèi)致病相關(guān)毒力基因的挖掘及功能研究是揭示其致病機制的有效方法，其與宿主細胞相互作用的過程中，能根據(jù)所遇到的不同生境，隨時調(diào)整多

3、個毒力基因的表達模式，從而使細菌可在宿主中適應性生存。由于病原菌與宿主互作是一個多因子作用的復雜過程，目前對其致病性的研究已逐漸從過去對單個基因的功能研究，轉(zhuǎn)變?yōu)閺恼w水平分析宿主和病原菌的相互作用。而轉(zhuǎn)座突變技術(shù)已成為發(fā)現(xiàn)新基因、發(fā)掘已知基因新功能的有效途徑之一，有利于我們開展高通量地體內(nèi)致病毒力基因的篩選。
　　本研究對強毒株Lm XYSN進行了比較基因組學分析，對毒力調(diào)控因子PrfA特有氨基酸突變以及新基因組島8的功能進行了

4、探究;另外，利用轉(zhuǎn)座突變技術(shù)建立Lm XYSN突變體文庫，以人結(jié)腸癌上皮細胞為篩選模型，進行毒力相關(guān)基因的全基因組水平高通量篩選、鑒定與功能研究。Lm XYSN毒力相關(guān)基因的挖掘及功能的解析，有利于揭示其在宿主體內(nèi)適應生存的機制，為李斯特菌病的預防與控制奠定理論基礎(chǔ)。
　　1、Lm XYSN PrfA氨基酸替換突變株的構(gòu)建及生物學特性研究
　　對31株李斯特菌毒力調(diào)控因子PrfA的比較分析顯示，Lm XYSN PrfA蛋白存

5、在兩處氨基酸自然突變Lys10Asn以及Thr151Ala。利用PyMOL軟件對突變位點的氨基酸進行分析，發(fā)現(xiàn)位于第10位氨基酸突變改變了蛋白表面的電子分布，而第151位氨基酸突變位點則是位于PrfA變構(gòu)活化熱點區(qū)。由此提示，毒力調(diào)控因子PrfA氨基酸的自然突變可能影響到其調(diào)控作用，從而對Lm XYSN的體內(nèi)致病特性產(chǎn)生影響。
　　為了研究PrfA的自然突變對Lm XYSN毒力的影響，利用同源重組技術(shù)分別構(gòu)建了prfA缺失突變株L

6、m XYSN△prfA以及第10位和151位氨基酸突變回復菌株Lm XYSNPrfA10K/151T。生物學特性測定結(jié)果顯示，突變株及回復株在BHI培養(yǎng)基中的生長能力與野生菌株一致，氨基酸替換回復突變株的溶血活性也與野生株的相同。RT-PCR檢測細菌感染細胞過程中毒力島1(LIPI-1)中基因的轉(zhuǎn)錄表達水平，結(jié)果顯示XYSN PrfA氨基酸突變后，其mRNA表達水平比野生株降低一倍，actA、hly、plcA以及mpl轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，

7、提示Lm XYSN PrfA的自然突變增強了對LIPI-1中基因的調(diào)控能力。以非吞噬細胞系Caco-2 BBE以及HeLa細胞系為體外感染模型的測定結(jié)果表明，Lm XYSN PrfA氨基酸的自然突變顯著提高了細菌對Caco-2 BBE的增殖能力以及HeLa感染的黏附、侵襲以及增殖能力;而以小鼠口服感染測定的LD50結(jié)果表明，回復菌株Lm XYSN PrfA10K/151T毒力比野生株降低7.34倍。上述實驗結(jié)果提示，Lm XYSN Pr

8、fA蛋白第10位和151位氨基酸突變提高了prfA自身轉(zhuǎn)錄水平以及對LIPI-1中基因的轉(zhuǎn)錄表達水平，增強了Lm XYSN對非吞噬細胞的黏附侵襲能力，影響了細菌在宿主體內(nèi)的致病能力。
　　2、Lm XYSN基因組島8突變株的構(gòu)建及生物學特性研究
　　對基因組島8內(nèi)分布的基因比對分析，選擇與其它李斯特菌同源性較低的基因簇(XYSN_0819、XYSN_0820、XYSN_0821和XYSN_0822)進行功能的初步研究。采用同

9、源重組技術(shù)對該基因簇進行敲除，并對Lm XYSN△XYSN0819-0822不同條件下的生長能力以及不同溫度下生物被膜的形成能力進行了測定。結(jié)果表明，突變株Lm XYSN△XYSN0819-0822在BHI培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)中生長速率均顯著低于野生株(P＜0.05)，耐受1％ Triton的能力顯著弱于野生株(P＜0.05)，且在37℃和42℃形成生物被膜的能力也顯著下降(P＜0.05;P＜0.01)。
　　以細胞系Caco-2

10、BBE、HeLa為體外感染模型、BABL/c小鼠為體內(nèi)感染模型，對XYSN_0819-0822缺失株的侵襲能力、小鼠致病能力進行測定。結(jié)果表明，XYSN_0819-0822缺失對細菌侵襲Caco-2 BBE、HeLa細胞系的胞內(nèi)增殖能力造成顯著影響(P＜0.05)，并降低了對小鼠的致病力。上述研究結(jié)果表明，Lm XYSN基因組島8中XYSN_0819、XYSN_0820、XYSN_0821以及XYSN_0822構(gòu)成的基因簇參與該菌生長代

11、謝、生物被膜形成和胞內(nèi)增殖，提高其在不利環(huán)境中的抵抗能力，促進在宿主細胞中的適應性生存。
　　3、Lm XYSN新毒力相關(guān)基因的篩選及功能研究
　　利用Mariner家族中的TnYLB-1轉(zhuǎn)座元件構(gòu)建了含有6000個Lm XYSN突變子的轉(zhuǎn)座突變體文庫，從中隨機挑取1127個突變子，以人結(jié)腸癌上皮細胞系Caco-2 BBE建立突變子篩選模型進行毒力相關(guān)基因的篩選，共獲得增殖能力下降5倍以上的突變株15株，其中包括降低20倍以

12、上的3株突變株。利用反向PCR(reverse PCR)和測序分析，對3株突變株的插入位點進行了鑒定，它們的轉(zhuǎn)座插入位點分別位于XYSN_0462、XYSN_1095以及XYSN_1098中。其中XYSN_0462是已知的在感染非吞噬細胞中發(fā)揮重要作用的內(nèi)化素基因inlA，由此證明本研究采用的細胞模型篩選Lm XYSN毒力因子方法的可行性。
　　對XYSN_1095∷Tn和XYSN_1098∷Tn在BHI培養(yǎng)基中生長能力測定結(jié)果顯

13、示，基因的插入失活對細菌的生長能力未造成明顯影響。通過掃描電子顯微鏡對細菌形態(tài)進行觀察則發(fā)現(xiàn)，XYSN_1095∷Tn和XYSN_1098∷Tn的菌體變短且部分菌體發(fā)生彎曲。對Caco-2BBE的黏附、侵襲以及胞內(nèi)增殖能力進行測定結(jié)果表明，XYSN_1095和XYSN_1098的基因突變，極顯著降低了細菌的侵襲與增殖能力。同時，對XYSN_1095∷Tn以及XYSN_1098∷Tn口服感染BABL/c小鼠LD50測定結(jié)果顯示，XYSN_