維甲酸對雞胚原始生殖細(xì)胞增殖和粘附的作用.pdf

1、作為性腺發(fā)育研究的重要動物模型,家禽提供了更直觀、方便的研究途徑。其中,家禽原始生殖細(xì)胞(primordial germ cell, PGC)的體外培養(yǎng)和調(diào)控的成功,為胚胎生殖細(xì)胞系的建立和保存,以及轉(zhuǎn)基因家禽的研究提供了堅實的基礎(chǔ)。然而,家禽PGC外源性調(diào)控的穩(wěn)定性和產(chǎn)量仍需提高,以保證相關(guān)研究的順利進(jìn)行。維甲酸(retinoic acid, RA)作為維生素A的代謝產(chǎn)物,在哺乳動物生殖發(fā)育中的作用被逐漸發(fā)現(xiàn),對多種細(xì)胞的增殖和細(xì)胞間

2、粘附有著重要的調(diào)節(jié)作用。本實驗以艾維因雞胚為材料,分離出胚胎期PGC,經(jīng)過原代和傳代培養(yǎng),對不同生長狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行多能性指標(biāo)的檢測和觀察,探討了RA對PGC體外增殖和細(xì)胞間粘附的影響,以及部分胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制。1.雞胚PGC原代和傳代培養(yǎng)模型的建立取培養(yǎng)至4d的雞胚,在體視顯微鏡下用玻璃針取其生殖嵴,用0.25％胰蛋白酶-0.02% EDTA消化組織,得到的細(xì)胞在含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)液中添加了10ng/m

3、l干細(xì)胞生長因子、10ng/ml白血病抑制因子、10ng/ml堿性成纖維生長因子、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、0.1mmol/L MEM非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素。對原代和傳代后形成的細(xì)胞集落進(jìn)行過碘酸雪夫氏反應(yīng)(PAS)、SSEA-1和SSEA-3免疫細(xì)胞化學(xué)檢測,同時利用RT-PCR檢測干細(xì)胞多能性基因PouV、Nanog和Sox2的表達(dá),均證實所形成的細(xì)胞集落是P

4、GC。上述實驗結(jié)果表明:PGC-體細(xì)胞原代及傳代于飼養(yǎng)層培養(yǎng)的模型可以作為PGC增殖活性調(diào)節(jié)的研究。2.雞胚PGC在體內(nèi)和體外培養(yǎng)時的形態(tài)取孵化至5d的雞胚,在體視顯微鏡下取出生殖嵴,經(jīng)4%多聚甲醛固定,經(jīng)常規(guī)脫水浸蠟,石蠟包埋,切片烤片后,進(jìn)行SSEA-1免疫組化熒光染色,定位PGC及其存在狀態(tài)。經(jīng)證實大量PGC存在于生殖嵴中,以單個或多個粘附的形式存在,同時證明了體內(nèi)PGC的多能性。體外培養(yǎng)的PGC經(jīng)定點(diǎn)觀察其生長狀況,確定PGC集

5、落的形成過程。另外,在不同時間階段經(jīng)觀察和SSEA-1免疫細(xì)胞熒光染色,以確定PGC集落生長的狀況。結(jié)果顯示:不同數(shù)量PGC的集落均有SSEA-1的表達(dá)。3.維甲酸對雞胚PGC增殖的調(diào)控利用已建立的PGC培養(yǎng)模型,探討了RA對體外培養(yǎng)的雞胚PGC增殖的調(diào)節(jié)作用。在傳代培養(yǎng)PGC的培養(yǎng)液中添加RA以及PKC信號途徑的抑制劑H7分別或聯(lián)合處理細(xì)胞,在不同時間點(diǎn)檢測PGC的多能性基因的表達(dá)。通過PAS染色,觀察并統(tǒng)計PGC集落的數(shù)量和面積的變

6、化。同時,通過RT-PCR檢測細(xì)胞周期蛋白基因CCND1和CCNE1、周期蛋白依賴性激酶CDK6和CDK2的表達(dá),以確定RA相關(guān)通路對細(xì)胞增殖的影響。PAS染色統(tǒng)計,10-7-10-5mol/LRA對體外培養(yǎng)PGC的數(shù)量和集落面積有明顯的提高效應(yīng)(P＜0.05);同時能顯著促進(jìn)相關(guān)檢細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)。其中,10-6mol/LRA的效果最為明顯。而在與H7聯(lián)合處理組中,RA的效應(yīng)明顯減弱。此結(jié)果表明,RA(10-7-10-5mol/

7、L)可促進(jìn)雞胚PGC的增殖,其中10-6mol/L濃度的RA作用效果最為明顯,此效應(yīng)可被10-6mol/L的H7所抑制。4.RA對雞胚PGC胞間粘附的影響利用已建立的PGC培養(yǎng)模型,探討RA對體外培養(yǎng)的雞胚PGC胞間粘附的調(diào)節(jié)作用。在傳代培養(yǎng)PGC的培養(yǎng)液中添加RA以及PKC信號途徑的抑制劑H7分別或聯(lián)合處理細(xì)胞。通過特定濃度的消化液消化PGC細(xì)胞團(tuán),并統(tǒng)計其集落數(shù)與單個細(xì)胞數(shù),以計算其粘附系數(shù)。通過RT-PCR檢測不同處理條件下粘附蛋

8、白鈣粘蛋白(E-鈣粘蛋白)和連鎖蛋白(α-和β-連鎖蛋白)mRNA表達(dá)的變化。粘附系數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果顯示:10-7-10-5mol/LRA明顯降PGC間的粘附系數(shù)(P＜0.05),表明PGC胞間粘附性增強(qiáng);同時能夠明顯促進(jìn)E-鈣粘蛋白、α-連鎖蛋白和β-連鎖蛋白的表達(dá)。而在H7聯(lián)合處理組中,RA的效應(yīng)明顯減弱。此結(jié)果表明:RA(10-7-10-5mol/L)可促進(jìn)雞胚PGC的胞間粘附,其中以10-6mol/L濃度RA的作用效果最為明顯,此效

9、應(yīng)可被10-6mol/L的H7所抑制。以上實驗結(jié)果表明:經(jīng)SSEA-1鑒定,雞胚生殖嵴內(nèi)的PGC以單個或少量聚合的形式存在。從雞胚生殖嵴分離的PGC原代和傳代培養(yǎng)后,經(jīng)PAS染色、SSEA-1和SSEA-3免疫細(xì)胞化學(xué)染色,及多能性基因PouV、Nanog和Sox2的RT-PCR檢測,證實所培養(yǎng)的PGC具有干細(xì)胞的多能性。定點(diǎn)觀察PGC的體外生長情況的結(jié)果證明,在培養(yǎng)的初期PGC集落的形成方式主要是聚集;之后主要是PGC集落細(xì)胞的自身分

10、裂增殖。對體外培養(yǎng)不同時期PGC的SSEA-1染色說明多個PGC傾向以細(xì)胞間粘附的形式生長。在此模型的基礎(chǔ)上,通過細(xì)胞集落數(shù)量和面積的統(tǒng)計,以及細(xì)胞周期調(diào)控基因CCND1/CDK6、CCNE1/CDK2 mRNA的表達(dá)變化結(jié)果說明,10-7-10-5mol/L的RA能促進(jìn)雞胚PGC的有絲分裂,從而促進(jìn)其增殖。同時,PKC途徑的抑制劑H7可減弱RA的促增殖作用。另外,通過粘附系數(shù)的統(tǒng)計,以及粘附蛋白基因表達(dá)變化檢測表明,10-7-10-5