雞原始生殖細(xì)胞及軟骨干細(xì)胞分離培養(yǎng)與生物學(xué)特性研究.pdf

1、干細(xì)胞因具有“無(wú)限”增殖和自我更新的特點(diǎn)，利用干細(xì)胞保存動(dòng)物遺傳資源將得到逐步認(rèn)可與應(yīng)用。但目前家禽干細(xì)胞仍存在分離培養(yǎng)效率低、生物學(xué)特性研究尚不明確等問(wèn)題。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了雞原始生殖細(xì)胞和軟骨干細(xì)胞體外分離方法、體外培養(yǎng)體系及其生物學(xué)特性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.采用胰酶消化法分離雞原始生殖細(xì)胞于雞胚成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)，細(xì)胞呈集落式生長(zhǎng);對(duì)純化細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶和PAS染色，細(xì)胞集落分別呈現(xiàn)藍(lán)紫色和紅色陽(yáng)性表達(dá)，并且集落具有形成

2、類胚體能力;對(duì)細(xì)胞進(jìn)行核型檢測(cè)，含有78條染色體，其中包含10對(duì)大染色體和29對(duì)微小染色體;對(duì)純化細(xì)胞進(jìn)行表面分子標(biāo)志鑒定，免疫熒光檢測(cè)顯示c-Kit、Oct4、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4表達(dá)陽(yáng)性，RT-PCR結(jié)果顯示Kit、Nanog、Sox2、DAZL和POUV均表達(dá)陽(yáng)性。以上結(jié)果顯示，所分離細(xì)胞集落為原始生殖細(xì)胞。利用成上皮誘導(dǎo)液對(duì)雞原始生殖細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定，CK-18和CK-19上皮標(biāo)

3、記基因呈陽(yáng)性表達(dá);利用成肝誘導(dǎo)液對(duì)雞原始生殖細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行糖原染色呈陽(yáng)性，誘導(dǎo)后細(xì)胞與肝細(xì)胞形態(tài)相符，RT-PCR檢測(cè)到肝細(xì)胞特異分子標(biāo)記AFP和ALB;利用成軟骨誘導(dǎo)液對(duì)雞原始生殖細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后細(xì)胞用阿利新藍(lán)染色可見藍(lán)色類似軟骨樣細(xì)胞團(tuán)，RT-PCR檢測(cè)到軟骨細(xì)胞分子標(biāo)記COL2A1、VIM、SO9和ACAN;利用精子誘導(dǎo)液對(duì)雞原始生殖細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后細(xì)胞呈精子樣生長(zhǎng)。結(jié)果顯示，原始生殖細(xì)胞具有多

4、潛能性，可向不同胚層細(xì)胞和生殖細(xì)胞分化。
　　2.采用鏈蛋白酶和膠原酶Ⅱ連續(xù)消化法分離雞軟骨干細(xì)胞，在體外可傳代培養(yǎng)到22代。細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形間充質(zhì)干細(xì)胞樣生長(zhǎng)，細(xì)胞核較大;生長(zhǎng)曲線顯示不同代次細(xì)胞具有不同的增殖能力;對(duì)細(xì)胞進(jìn)行核型鑒定，符合雞核型標(biāo)準(zhǔn)，包含10對(duì)可見染色體;對(duì)純化細(xì)胞進(jìn)行軟骨干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子標(biāo)志鑒定，免疫熒光檢測(cè)顯示Collgen1、Collgen2、Aggrecan1、Vimentin、Fgfr3和So

5、x9表達(dá)陽(yáng)性，RT-PCR結(jié)果顯示COL2A1、VIM、SOX9和ACAN均表達(dá)陽(yáng)性;利用流式細(xì)胞儀，對(duì)分離細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性率檢測(cè)，CD29、CD44、CD166和CD105間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因陽(yáng)性表達(dá)率均高于98％。以上結(jié)果表明，所分離細(xì)胞為軟骨干細(xì)胞。利用成脂誘導(dǎo)液對(duì)軟骨干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，可見紅色脂滴，RT-PCR檢測(cè)到脂肪細(xì)胞特異性分子標(biāo)記LPL和PPAR-γ;利用成骨誘導(dǎo)液對(duì)軟骨干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)

6、后細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色呈陽(yáng)性，RT-PCR檢測(cè)到成骨細(xì)胞特異性分子標(biāo)記COL1A2和SPP1;利用成軟骨誘導(dǎo)液對(duì)軟骨干細(xì)胞進(jìn)行3D培養(yǎng)，誘導(dǎo)后細(xì)胞團(tuán)形態(tài)類似軟骨球，對(duì)其進(jìn)行石蠟切片，并進(jìn)行阿利新藍(lán)和甲苯胺藍(lán)染色呈陽(yáng)性，在對(duì)其進(jìn)行免疫熒光染色，COL1A2和COL2A1均表達(dá)陽(yáng)性。結(jié)果表明，軟骨干細(xì)胞為專能干細(xì)胞。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在體外成功分離了雞原始生殖細(xì)胞和雞軟骨干細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，對(duì)雞多潛能干細(xì)胞和專能干細(xì)