17β-雌二醇對壽光雞原始生殖細胞發(fā)育的影響.pdf

1、原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)作為生殖干細胞，是禽類地方稀有品種遺傳資源保存及通過轉基因改良禽類品種的重要載體細胞。因此，PGCs的體內外發(fā)育研究，對建立禽類生殖腺嵌合體和轉基因技術平臺具有重要意義。17β-雌二醇(17β-estradiol，17β-E2)作為一種雌性激素，對多種細胞體細胞和生殖細胞的增殖具有重要促進作用。本研究以壽光雞28期胚胎為試驗材料，探討了17β-E2對體內外性腺原始生殖細

2、胞(Gonadal primordial germ cells，gPGCs)發(fā)育的影響。首先，制作28期雞胚性腺組織切片，進行PAS和HE染色，并在顯微鏡下進行形態(tài)鑒定;其次，雞胚發(fā)育到第X期，用雞蛋開窗法注入17β-E2，封口孵化至28期，用EDTA-胰酶解離法消化性腺組織，分離獲得gPGCs，觀察和分析17β-E2對gPGCs體內發(fā)育的影響;第三，孵化至28期胚胎（未經17β-E2處理），分離性腺，將分離的PGCs和性腺基質細胞共培

3、養(yǎng)，根據差速貼壁原理分離純化PGCs，培養(yǎng)于添加不同濃度17β-E2的培養(yǎng)液，觀察和分析17β-E2對gPGCs體外發(fā)育的影響。試驗結果如下:
　　 1、PGCs形態(tài)學研究
　　 組織切片觀察表明，gPGCs呈圓形或卵圓形，有偽足，直徑為10μm-15μm，胞核呈圓形或橢圓形，偏向細胞邊緣，大小為5μm-7.5μm。核內緣有少量異染色質，常染色質均勻分布。分離后的細胞懸液涂片觀察表明，游離的gPGCs呈圓形或卵圓形，有偽

4、足，周圍有明顯的光環(huán)，直徑為12.5μm-20μm。
　　 2、17β-E2對PGCs體內發(fā)育的影響
　　 17β-E2處理組雞胚的PGCs數量（1601±126個/枚）顯著高于(P＜0.05)注射乳化劑對照組（1327.5±210.4個/枚）和未注射乳化劑對照組（1401.80±312.5個/枚）。
　　 3、PGCs的分離純化
　　 分離未經17β-E2處理的28期壽光雞胚胎性腺，經酶消化，總細胞數為

5、(8.7±1.7)×104個/枚，其中gPGCs數量為1401.80±312.5個/枚，占總細胞數的1.61％。將分離后的gPGCs與性腺基質細胞共培養(yǎng)，經24h培養(yǎng)差速貼壁分離，獲得總細胞數為1542±589個/枚，其中gPGCs為432.5±106.5個/枚，回收率為36.52±4.86％，純度為28.1±1.9％，存活率71.7±2.2％。
　　 4、17β-E2對體外培養(yǎng)壽光雞原始生殖細胞的影響
　　 將分離純化

6、的PGCs分別培養(yǎng)于添加不同濃度(0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL)17β-E2的TCM199基礎培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1～6天。結果顯示，5ng/mL添加組與0ng/mL添加組比較，PGCs的發(fā)育能力無顯著差異，而10ng/mL和20ng/mL添加組與0ng/mL及5ng/mL添加組比較，PGCs的發(fā)育能力差異顯著(P＜0.05)。但是，10ng/mL和20ng/mL添加組之間比較，PGCs的發(fā)育能力無顯著差異。