體外培養(yǎng)的雞原始生殖細(xì)胞在早期胚胎遷移的研究.pdf

1、原始生殖細(xì)胞（Primodial germ cells，PGCs）作為配子的前體細(xì)胞，負(fù)責(zé)將遺傳信息傳遞給下一代。將分離的PGCs經(jīng)過體外培養(yǎng)擴(kuò)增以及轉(zhuǎn)基因修飾后，移植到受體胚內(nèi)能產(chǎn)生生殖系嵌合體，這是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因禽類的一個(gè)理想途徑。但在實(shí)際的研究操作中，由于對(duì)PGCs遷移和歸巢性腺知識(shí)的缺乏，轉(zhuǎn)基因嵌合體的制備方法沒有優(yōu)化，成功效率非常低。本研究旨在探索PGCs在注射到受體胚胎后的遷移機(jī)制以及影響其遷移效率的因素，為提高轉(zhuǎn)基因雞的生產(chǎn)效

2、率提供一定的依據(jù)。
　　首先，我們從廣西黃羽雞(yellow feather chicken，YF chicken)13-15期雞胚血液中分離PGCs進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，經(jīng)轉(zhuǎn)基因修飾后，對(duì)獲得的能穩(wěn)定遺傳的GFP-PGCs進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過體外培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因修飾的PGCs，SSEA-1染色呈陽性，RT-PCR分析結(jié)果顯示這些PGCs表達(dá)了Dazl、Cvh、PouV、Cdh、Nanog基因，說明了我們獲得的GFP-PGCs細(xì)胞株仍

3、保留其生物學(xué)特性。隨后，我們將雞胚隨機(jī)分成4組，分別孵育50h、55h、60h、65h后移植GFP-PGCs，探索受體胚齡對(duì)PGCs遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受體雞胚孵育50h移植PGCs的遷移效率較孵育55h、60h、65h組高，孵育時(shí)間越長移植PGCs遷移效率越低。在探究移植細(xì)胞數(shù)對(duì)PGCs遷移的影響試驗(yàn)中，雞胚隨機(jī)分成四組，孵育50h后分別注射1000、3000、10000、30000個(gè)GFP-PGCs，結(jié)果顯示，移植的最優(yōu)細(xì)胞數(shù)為1

4、0000個(gè)/胚，移植的PGCs少于10000個(gè)/胚時(shí)，隨著移植細(xì)胞數(shù)的增加，遷移的PGCs增加，當(dāng)移植的PGCs多于10000個(gè)/胚時(shí)，遷移的PGCs不再增加。我們將移植10000個(gè)PGCs的雞胚孵出，出殼4d小雞睪丸內(nèi)發(fā)現(xiàn)外源GFP-PGCs，證明了外源GFP-PGCs能在受體性腺內(nèi)生長增殖。隨后，成熟雄性嵌合體雞精液DNA PCR結(jié)果顯示，4個(gè)假定嵌合體中有1個(gè)呈GFP陽性。最后，我們探究了CXCR4信號(hào)通路在PGCs遷移過程中的作

5、用。RT-PCR結(jié)果顯示，PGCs表達(dá)了趨化因子受體Cxcr4基因。此外，我們?cè)谝浦驳募?xì)胞滴中分別添加CXCR4信號(hào)通路抑制劑AMD3100和WZ811，AMD3100濃度為0nM、10nM、50nM，WZ811為0nM、1nM、2nM，試驗(yàn)結(jié)果表明，50nM AMD3100以及1nM、2nM WZ811能明顯抑制PGCs的遷移(P＜0.05)。證明了SDF-1/CXCR4信號(hào)通路參與調(diào)控PGCs在早期雞胚中的遷移和歸巢。
　　綜