雞胚原始生殖細胞體外轉(zhuǎn)染及其介導的轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、雞胚胎原始生殖細胞(Embryonic Primordial Germ Cells，EPGCs)是形成精子和卵子的祖先細胞，在飼養(yǎng)細胞層和多種生長因子的共同作用下，可成為長期增殖并維持不分化狀態(tài)的多能性干細胞。本研究以第19期發(fā)育的雞EPGCs為實驗材料，以增強性綠色熒光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP)為報告基因，比較了不同轉(zhuǎn)染方法對雞EPGCs的轉(zhuǎn)染效率，并對電穿孔轉(zhuǎn)染條件進行了比較和優(yōu)

2、化；同時，通過細胞毒性敏感實驗確立快速篩選轉(zhuǎn)基因陽性細胞的G418(氨基糖甙類新霉素衍生物，Geneticin)適合量，進行體外快速篩選轉(zhuǎn)染細胞的探索，并嘗試將篩選后的陽性EPGCs通過顯微注射法注入囊胚期胚盤中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞，為利用EPGCs介導生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞提供參考依據(jù)。實驗結(jié)果如下： 1．采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔轉(zhuǎn)染法和磷酸鈣甘油休克法等4種方法，以EGFP為報告基因，對19期第2代的雞EPGCs進行轉(zhuǎn)染，結(jié)果表

3、明，電穿孔轉(zhuǎn)染率最高，為17.096％；磷酸鈣甘油休克法轉(zhuǎn)染率次之，為12.554％；磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染率為7.866％；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染率最低，為1.138％。 2．以EGFP為報告基因，電穿孔轉(zhuǎn)染19期第2代雞EPGCs，比較電壓、脈沖時程、質(zhì)粒濃度和溫度等因素對轉(zhuǎn)染率的影響。結(jié)果顯示：(1)當電壓分別為180V、230V、280V、330V和380V時，轉(zhuǎn)染率分別為12.520％、14.408％、18.635％、17.94

4、4％和13.765％，轉(zhuǎn)染率在280V時最高，與除330V以外的其它電壓下的轉(zhuǎn)染率存在極顯著的差異(P<0.01)； (2)當脈沖時程分別為401μs、60μs、80μs和1001μs時，轉(zhuǎn)染率分別為12.520％，16.143％，14.715％和12.368％，轉(zhuǎn)染率在601μs時最高，與其它脈沖時程下的轉(zhuǎn)染率之間均存在極顯著的差異(P<0.01)；(3)當質(zhì)粒濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL和20gg/mL時，

5、轉(zhuǎn)染率分別為8.300％、12.520％、17.948％和17.577％，轉(zhuǎn)染率在質(zhì)粒濃度為15μg.mL<'-1>時最高，與除20μg/mL<'-1>之外的其它濃度下的轉(zhuǎn)染率差異極顯著(P<0.01)；(4)當作用的溫度分別為25℃和4℃時，轉(zhuǎn)染率分別為12.520％和4.634％，兩者之間存在極顯著差異(P<0.01)。 3．為了確定EPGCs對G418的耐受能力，獲得快速篩選：EPGCs的G418適宜量，本研究對EPGCs進行了細

6、胞毒性敏感實驗。結(jié)果表明：EPGCs分別在G418濃度為100μg/mL、2001μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500gg/mL和600gg/mL的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，可存活時間分別為15d、14d、10d、8d、5d和3d。用含有G418濃度為400μg/mL的培養(yǎng)基，對轉(zhuǎn)染48h后的EPGCs進行快速篩選，結(jié)果在篩選第6d時，出現(xiàn)．EPGCs陽性克隆，篩選第8d時，非陽性細胞全部死亡。 4．以EGFP為報告基因

7、，電穿孔轉(zhuǎn)染，篩選8d后陽性EPGCs注射到雞胚中，進行轉(zhuǎn)基因雞制備的初步嘗試。結(jié)果顯示：注射112枚受精蛋，孵化發(fā)育至15d時全部死亡。對孵化后1-7胚齡的死亡全胚及8-15胚齡死亡雞胚的肌肉、肝臟、心臟和腎臟組織進行．PCR．檢測，結(jié)果表明，孵化后1d-3d和4d-7d時，全胚DNA的：PCR．陽性率分別為52.63％和31.58％，8d-11d的陽性率為20.00％，12d-13d的陽性率為10.00％，14d-15d的陽性率為5