水稻OsCAS（Calcium-sensing Receptor）基因的克隆及功能分析.pdf

1、Ca<'2+>是動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí) Ca<'2+>信號(hào)傳遞又是細(xì)胞中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，參與和調(diào)節(jié)著生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、抗逆等生理反應(yīng)。胞內(nèi)Ca<'2+>作為重要的第二信使，控制著許多細(xì)胞功能，人們對(duì)此研究得已經(jīng)比較深入。直到1993年，Brown et al．首次從牛副甲狀腺中克隆到了一個(gè)G-蛋白耦聯(lián)的胞外 Ca<'2+>敏感受體(CaR)，使人們認(rèn)識(shí)到Ca<'2+>在細(xì)胞外也發(fā)揮著信使的功能。2003年Ha

2、n and Pei 在擬南芥葉片中采用表達(dá)克隆的方法克隆到一個(gè)胞外Ca<'2+>敏感受體(CAS)，能夠感受胞外Ca<'2+>濃度的升高，從而引起胞內(nèi)Ca<'2+>濃度的升高。這個(gè)受體的克隆使人們認(rèn)識(shí)到在植物當(dāng)中Ca<'2+>也可以發(fā)揮第一信使的作用。我們利用擬南芥CAS基因序列在GeneBank中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)水稻中存在與之相似性很高的序列，采用同源克隆的策略，在水稻中克隆了OsCAS基因，并對(duì)它的序列和功能作了初步的分析和研究。所得序列

3、在GenBank注冊(cè)，基因號(hào)：AY476807。序列分析表明，OsCAS包含1164個(gè)堿基對(duì)，編碼387個(gè)氨基酸；在水稻基因組中為單拷貝；計(jì)算機(jī)軟件分析該蛋白具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在30-50氨基酸處有一段導(dǎo)肽序列。推測(cè)OsCAS的C-端位于細(xì)胞內(nèi)，它的作用可能與蛋白質(zhì)問(wèn)的相互作用有關(guān)，在C端具有一個(gè)硫氰酸酶結(jié)構(gòu)域，這個(gè)保守區(qū)域在磷脂酶和多種蛋白中都有發(fā)現(xiàn)，比如在硫氰化酶和一些抗性蛋白中，推測(cè)它有可能在一些抗逆反應(yīng)中具有一定的作用；N-端

4、位于胞外，具有幾個(gè)酸性氨基酸殘基能夠結(jié)合Ca<'2+>，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他保守區(qū)域，并且與擬南芥CAS的同源性也較差，可能與胞外Ca<'2+>的結(jié)合方式的多樣性有關(guān)。為研究OsCAS基因的功能，我們做了以下幾方面的工作： 1．在HEK293細(xì)胞系中表達(dá)OsCAS。用空載體pcDNA<,3>、水稻OsCAS、擬南芥CAS轉(zhuǎn)化HEK293細(xì)胞系。當(dāng)[Ca<'2+>]。由0.1mM升高到2.5mM時(shí)，我們觀察到胞內(nèi)Ca<'2+>信號(hào)迅速上

5、升，說(shuō)明OsCAS具有感受胞外Ca<'2+>濃度升高從而引起胞內(nèi)Ca<'2+>濃度升高的功能。 2．進(jìn)行OsCAS的細(xì)胞學(xué)定位。構(gòu)建UBQ p∶∶CAS∶∶eGFP和UBQ p∶∶eGFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)OsCAS定位在質(zhì)膜上。 3．對(duì)OsCAS表達(dá)部位進(jìn)行研究。提取水稻不同部位(根、莖、葉)的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，結(jié)果表明，OsCAS在葉中表達(dá)量很高，莖中

6、也有表達(dá)，但明顯低于葉中的表達(dá)量，在根中幾乎不表達(dá)。 4．對(duì)OsCAS功能進(jìn)行研究。構(gòu)建OsCAS的sense和anti-sense表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，得到CAS超表達(dá)和轉(zhuǎn)基因抑制植株T<,0>代。T<,0>代anti-sense轉(zhuǎn)基因植株在生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)方面與野生型植株相比明顯遲緩。對(duì)其T<,1>代進(jìn)行抗逆性研究，發(fā)現(xiàn)在OsCAS的表達(dá)明顯被抑制的情況下，用200mM NaCl處理24小時(shí)后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對(duì)NaCl敏感，轉(zhuǎn)基因

7、植株的葉綠素含量和葉片游離脯氨酸含量明顯低于野生型，而且在外加Ca<'2+>的情況下，植物的鹽脅迫癥狀沒(méi)有明顯的改變，而野生型的植株在相同條件下鹽脅迫的癥狀有所緩解。通過(guò)對(duì)OsCAS基因的序列及功能分析可以得出以下結(jié)論：CAS是位于質(zhì)膜表面的Ca<'2+>受體，能夠感受胞外Ca<'2+>濃度的變化，從而引起胞內(nèi)Ca<'2+>濃度變化。OsAS基因的表達(dá)對(duì)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育非常重要，當(dāng)該基因受到抑制，植株表現(xiàn)出長(zhǎng)勢(shì)弱、抽穗晚，抗逆(鹽)性降低

8、。我們分析產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能有兩個(gè)：第一，CAS作為IP<,3>途徑的受體，能夠引起Ca<'2+>從細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放出來(lái)，當(dāng)它被抑制時(shí)，細(xì)胞的PLC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被破壞，不能引起胞內(nèi)Ca<'2+>濃度增加，影響了逆境應(yīng)答基因的表達(dá)，而且IP<,3>途徑的破壞，使Pro的積累受到影響，而脯氨酸的積累是生物有機(jī)體對(duì)環(huán)境脅迫產(chǎn)生的一種應(yīng)答反應(yīng)，能夠增強(qiáng)植物的抗逆能力。第二，在高鹽條件下Ca<'2+>對(duì)于排斥Na<'+>而加強(qiáng)K<'+>的選擇性