水稻OsSIZ1和OsAPX2基因的克隆和功能分析.pdf

1、本論文的研究內容主要包括兩個部分： 1)水稻T-DNA插入突變體siz1的分析和OsSIZ1基因的功能研究； 2)水稻抗壞血酸過氧化物酶OsAPX2的克隆和功能分析。 水稻是世界上重要的糧食作物之一，又是研究單子葉植物和禾本科植物的模式植物。水稻基因組測序工作圓滿結束后，研究的主要任務就是解讀基因組。突變體尤其是標簽突變體無疑是研究基因功能的好材料，目前通過世界上很多國家科學家的努力已經建成了有相當規(guī)模的水稻突變

2、體庫，充分利用這些突變體資源來挖掘和鑒定基因的功能是當前很多研究人員在從事的工作，我們實驗室也在這方面做了一些工作，并得到了一些有意義的結果。在對本實驗室創(chuàng)制的水稻增強子捕獲突變體庫研究的過程中，我們從中選取了突變表型和T-DNA標簽共分離的兩個突變體進行基因功能的研究， 主要研究內容和結果如下： 1.水稻突變體siz1在MS培養(yǎng)基上生長一周后發(fā)現(xiàn)突變體的側根與對照日本晴相比側根稠密，該表型與T-DNA插入共分離，側翼序

3、列的分析表明T-DNAA正向插入在水稻第5染色體上的基因OSJNBb0079L11.3的第三內含子，與擬南芥的SUMOE3連接酶AtSIZ1在核苷酸序列的相似性達51.63％。Southernblot結果表明突變體中僅有一個拷貝的T-DNA插入，且無Tos17新的轉座位點出現(xiàn)。對雜合突變植株后代的GUS染色結果表明該基因符合孟德爾規(guī)律，說明該基因為單基因。OsSIZ1基因的啟動子驅動GUS基因在根、莖、葉、花和花粉等組織中表達，在花和根

4、中的染色較其它組織更深，說明該基因在花和根中強烈表達。35S啟動子驅動下的OsSIZ1和GFP融合表達載體的轉基因煙草幼苗在激光共聚焦顯微鏡下觀察，根細胞的細胞核和細胞外周發(fā)出強烈的綠色熒光。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)與日本晴相比，該突變體幼苗的地上部生長素含量低于日本晴，而根中生長素含量高于日本晴，外源生長激素IAA對突變體的主根和冠根有明顯抑制作用。從野生型植株中獲得該基因的全長cDNA發(fā)現(xiàn)有兩種轉錄本，將兩種轉錄本分別構建功能互補載體導

5、入突變體中，將T0代轉基因植株的后代T1種子用來鑒定根系表型恢復情況，發(fā)現(xiàn)在帶有較長的轉錄本的轉基因株系中有一個株系的根系發(fā)生表型分離，既有野生型也有突變型，這一結果與預期表型一致，說明通過引入野生型基因可以恢復突變表型，功能互補實驗成功。同時為了比較該基因與擬南芥中的同源基因的差異，我們還把OsSIZ1基因導入擬南芥同源突變體siz1中，OsSIZ1基因的引入可以使植株矮小、長勢弱的突變體的表型恢復到接近野生型植株，擬南芥功能互補實驗

6、結果初步證明了OsSIZ1基因與擬南芥中的同源基因AtSIZ1基因在功能上有相似之處。本研究結果為深入研究SUMO化在水稻生長發(fā)育過程中扮演的角色提供了有用的線索，同時也為研究單子葉與雙子葉植物中SUMO化的異同提供了參考。 2.水稻矮桿不育突變體apx2中T-DNA插在OsAPX2的第四內含子，OsAPX2基因的表達完全被抑制后，導致水稻花藥生長畸形，花粉活力嚴重下降，植株不能結實。apx2突變體的側翼序列擴增也僅擴增到一個T

7、-DNA插入而沒有Tos17的新位點，矮桿不育性狀與T-DNA插入共分離，這些結果意味著該基因的突變可能是導致突變表型的原因，因此我們進行了功能互補實驗。將OsAPX2基因導入純合突變體后，T0代再生植株可以結實，植株高度恢復到接近野生型水稻的高度。OsAPX2基因的啟動子驅動GUS基因在根、葉、莖節(jié)、葉舌、花和花藥表達，說明抗壞血酸過氧化物酶APX2在水稻中廣泛存在。OsAPX2基因和GFP融合表達后在轉基因煙草根細胞的細胞質和細胞外

8、周發(fā)出可見綠色熒光。對突變體、互補轉基因植株和過量表達植株葉片進行組織化學染色(DAB和NBT)，發(fā)現(xiàn)突變體中活性氧含量高于對照，而互補轉基因植株中的活性氧含量與野生型一致，說明OsAPX2基因的突變導致水稻葉片活性氧含量升高，尤其是H2O2的含量升高。 研究還發(fā)現(xiàn)植株體內過量表達OsAPX2并不能提高植物清除活性氧的能力，相反會造成脅迫，說明植物體內活性氧的產生與清除存在一個動態(tài)的、精妙的平衡，不容打破。 研究結果表明