水稻直立穗基因EP2的克隆與功能分析.pdf

1、隨著全球人口的持續(xù)增長(zhǎng)，糧食短缺問題將越來越嚴(yán)重，因此增加糧食產(chǎn)量將是本世紀(jì)人類所面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。植物株型的改良一直被認(rèn)為是提高糧食產(chǎn)量的一個(gè)有效方法。最明顯的例子就是半矮桿基因在水稻和小麥上的應(yīng)用，從而改善了植株株型并大大提高了植株產(chǎn)量的潛力。除了株高以外，分蘗、穗和葉形態(tài)也是作物高產(chǎn)株型重要指標(biāo)。其中穗部性狀，由于直接決定作物產(chǎn)量，因此也是個(gè)重要的農(nóng)藝性狀之一。水稻的穗型主要由一次枝梗的數(shù)目和每個(gè)一次枝梗上的穎花數(shù)目決定的。從8

2、0年代以來，直立穗型品種在我國(guó)粳稻種植區(qū)大面積的推廣。直立穗型品種的穗和葉一般都短而直立，有利于通風(fēng)的改善和光照，因此直立穗型品種表現(xiàn)出較高的光合作用和物質(zhì)生產(chǎn)能力。因此，直立穗型被認(rèn)為是一種優(yōu)良性狀，應(yīng)用于水稻株型的改良。但是由于直立穗出現(xiàn)較晚，目前對(duì)其研究還是不多，其基本的分子機(jī)制還不是很清楚。而且目前直立穗型品種都是來自粳稻，至今沒有的秈型直立穗型品種的釋放。
　　 我們通過篩選和收集突變體資源，共獲得2個(gè)新的直立穗等位突

3、變體，ep2-1和ep2-2，分別來源于中秈3037和93-11。以這兩個(gè)突變體為試驗(yàn)材料，采用圖位克隆的方法，克隆該直立穗基因，EP2。并綜合利用分子生物學(xué)、植物生理學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)，研究了該基因在水稻中的部分功能，初步分析了突變體穗部直立的原因，為進(jìn)一步深入研究水稻穗部直立提供一些理論依據(jù)并為分子育種研究提供關(guān)鍵基因。主要結(jié)果如下：
　　 1.通過遺傳分析，將ep2-1與中花11進(jìn)行雜交，雜種F1代植株表現(xiàn)為野

4、生型表型，F(xiàn)2群體中的野生型個(gè)體和直立穗個(gè)體的分離比列符合3∶1，表明該直立穗突變體受一個(gè)隱性單基因控制。并通過圖位克隆的方法，在第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂上克隆了該直立穗基因，EP2。序列分析表明，該基因在2個(gè)ep2等位突變體中發(fā)生了不同性質(zhì)的突變。而且基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明將野生型基因?qū)胪蛔冎仓曛心軌蚧謴?fù)突變體表型。這說明我們克隆的EP2基因就是一個(gè)控制水稻穗部直立的基因。
　　 2.EP2基因在水稻基因組中為單拷貝基因，由10個(gè)外顯

5、子和9個(gè)內(nèi)含子組成，編碼一個(gè)具有1365個(gè)氨基酸的蛋白。通過同源序列比較，我們發(fā)現(xiàn)該蛋白是植物特有的蛋白，在禾本科作物中高度同源，說明該蛋白在禾本科中可能具有相同功能。該蛋白是一個(gè)未知功能的蛋白，沒有發(fā)現(xiàn)保守結(jié)構(gòu)域。
　　 3.該基因具有多效性。除了影響穗部性狀，還影響其它性狀，如種子大小、葉片大小和植株高度等。通過組織切片觀察，我們發(fā)現(xiàn)ep2突變體與野生型相比，不僅維管束多，特別是小維管束，而且有更多的厚壁細(xì)胞。此外，突變體最

6、上節(jié)莖桿直徑也比野生型粗。這表明突變體的莖桿強(qiáng)度要比野生型大，這是ep2突變體穗部直立的原因之一。
　　 4.通過半定量RT-PCR分析表明EP2基因主要在莖，葉，幼穗中表達(dá)，其中在穗中的表達(dá)量最高。對(duì)EP2基因的啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告顯示，EP2基因在莖、葉和葉鞘的維管束中表達(dá)。在生長(zhǎng)點(diǎn)，腋芽，葉枕和幼穗等生長(zhǎng)旺盛的地方都能夠檢測(cè)到GUS活性。這說明EP2基因表達(dá)具有較強(qiáng)的時(shí)空性。
　　 5.通過構(gòu)建35S∶EP2-GF

7、P融合載體，再通過原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)研究了EP2蛋白在細(xì)胞中的定位。結(jié)果表明，EP2-GFP融合蛋白在細(xì)胞中是網(wǎng)狀分布的，而且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異標(biāo)記(ER-mCherry)是共定位的。這說明EP2蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的，這些結(jié)果為研究EP2蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 6.通過半定量RT-PCR分析GA合成相關(guān)基因在突變體的表達(dá)，我們可以看出OsGA20ox3和OsGA3ox1在突變體中顯著下降。GA20ox基因和GA3ox基因在植

8、物基因組中都是以基因家族形式存在的，在GA合成途徑中起關(guān)鍵作用，特別在形成有活性的GA分子。這說明EP2蛋白通過調(diào)節(jié)OsGA20ox3和OsGA3ox1基因的表達(dá)參與了GA合成過程，從而造成了植株變矮。
　　 7.在成熟期對(duì)植株性狀統(tǒng)計(jì)分析，表明直立穗ep2-2突變體能夠改良水稻穗型。ep2-2突變體進(jìn)一步降低植株高度、莖桿粗以及穗部保持直立，這些特性提高了植株的抗倒伏性。此外，ep2-2突變體每穗粒數(shù)要比野生型93-11多，具

9、有增產(chǎn)的潛力。
　　 綜上所述，根據(jù)本研究的結(jié)果可以達(dá)到以下結(jié)論：(1)我們?cè)?號(hào)染色體上克隆了一個(gè)新的直立穗基因，EP2，該基因突變體能增加莖桿維管束和厚壁細(xì)胞數(shù)目，增加莖桿直徑，從而導(dǎo)致突變體穗部直立；(2)EP2基因編碼一個(gè)植物特有的，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的新蛋白，但其功能未知；(3)EP2基因的表達(dá)具有很強(qiáng)的時(shí)空性；(4)EP2基因調(diào)控GA合成基因的表達(dá)，從而影響植株株高；(5)EP2基因在育種工作中具有極強(qiáng)的應(yīng)用前景，完全可以