水稻多效性基因Ghd7的克隆和功能分析.pdf

1、植物通過感知復(fù)雜的環(huán)境信號(hào)，從而調(diào)整各種生長(zhǎng)發(fā)育的過程，最終完成物種的存活和延續(xù)。而在水稻中，這種因?yàn)榄h(huán)境信號(hào)而產(chǎn)生的生長(zhǎng)發(fā)育過程的改變往往導(dǎo)致了重要農(nóng)藝性狀的巨大變化，最終深刻的影響到水稻產(chǎn)量。因此研究水稻如何響應(yīng)環(huán)境變化調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育同時(shí)具有理論和應(yīng)用的意義。該課題對(duì)水稻第七染色體著絲粒附近一個(gè)同時(shí)控制抽穗期、株高和穗粒數(shù)的主效QTL基因Ghd7進(jìn)行克隆和功能研究，首次在水稻中成功克隆到Ghd7這樣一個(gè)一因多效的重要農(nóng)藝性狀基因。利用

2、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等手段初步闡明Ghd7在水稻中處于信號(hào)樞紐的中心地位，通過整合多種環(huán)境信號(hào)（光質(zhì)，日長(zhǎng)，溫度，脅迫等），調(diào)節(jié)自身轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，最終達(dá)到控制水稻時(shí)期轉(zhuǎn)換，株型建成和脅迫反應(yīng)等過程的目的。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.多效基因Ghd7的克隆
　　利用RACE的方法分離到Ghd7的全長(zhǎng)cDNA，發(fā)現(xiàn)Ghd7為一個(gè)新的CCT結(jié)構(gòu)域基因，與擬南芥中已發(fā)表的CCT基因不具有顯著的同源關(guān)系。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明Ghd7定

3、位于細(xì)胞核，并且具有轉(zhuǎn)錄抑制的活性。表達(dá)譜分析顯示，Ghd7主要在葉片表達(dá)，并且從葉尖向葉基梯度遞減。同時(shí)該基因又受到光周期和晝夜節(jié)律的調(diào)控，即特異在長(zhǎng)日照條件下的白天表達(dá)，表達(dá)峰值處于黎明時(shí)分。長(zhǎng)日照條件下，Ghd7的表達(dá)直接導(dǎo)致對(duì)水稻抽穗期基因的強(qiáng)烈抑制，從而導(dǎo)致抽穗延遲的表型。Ghd7-Ehd1-Hd3a代表了水稻中獨(dú)有的開花調(diào)控途徑，并且Ghd7-Ehd1-Hd3a在表達(dá)量上具有一種級(jí)聯(lián)放大的特性。通過對(duì)五個(gè)品種中Ghd7位點(diǎn)的

4、比較測(cè)序，鑒定出四種Ghd7的等位基因型。其中HR5和TQ在Ghd7位點(diǎn)分別具有強(qiáng)等位基因型Ghd7-1和Ghd7-3;ZH11在Ghd7位點(diǎn)包含弱等位基因型Ghd7-2;而MDJ8和HJ19則在Ghd7位點(diǎn)發(fā)生終止突變，定義為Ghd7-0a。此外我們還發(fā)現(xiàn)不同的Ghd7等位基因在3'UTR區(qū)域存在AT重復(fù)序列的多態(tài)性。以上結(jié)果說明Ghd7基因參與了水稻自然變異和選擇育種的過程，在增加水稻產(chǎn)量潛力和適應(yīng)性方面具有重要作用。
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5、.Ghd7在水稻中的功能
　　遺傳結(jié)果表明，Ghd7的表達(dá)量的高低與抽穗期，株高和穗粒數(shù)的表型程度呈正相關(guān)，說明Ghd7存在劑量效應(yīng)。然而在ZH11背景中，超量表達(dá)Ghd7雖然能夠顯著延遲抽穗期，但是對(duì)株高和穗粒數(shù)的促進(jìn)作用只在短日照條件下才能顯著的表現(xiàn)出來，說明Ghd7對(duì)穗型和株高的調(diào)控依賴于遺傳背景和環(huán)境的變化。遺傳和分子的結(jié)果表明Ghd7介導(dǎo)PHYB-OsTB1的途徑調(diào)控分蘗，其中GHD7蛋白含量在phyB突變體中顯著降低。

6、此外ABA、JA、干旱以及高溫均可以抑制Ghd7的表達(dá)量，而低溫則能夠促進(jìn)Ghd7的表達(dá)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)Ghd7和抑制Ghd7分別能夠增強(qiáng)和降低水稻幼苗對(duì)干旱脅迫的敏感性。說明Ghd7在水稻中處于信號(hào)傳導(dǎo)的中心樞紐，整合來自環(huán)境的各種信號(hào)，參與水稻的時(shí)期轉(zhuǎn)換，株型調(diào)控以及脅迫反應(yīng)。
　　3.Ghd7分子機(jī)制的研究
　　為了研究Ghd7的下游途徑，我們利用RNA-seq的策略，在黎明、正午、黃昏和午夜四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)phy

7、B突變體、Ghd7超量表達(dá)和抑制的材料進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，得到PHYB和Ghd7在一天中不同時(shí)間點(diǎn)的調(diào)控基因。為了研究Ghd7的互作蛋白，我們將GHD7與3×Flag標(biāo)簽融合并在轉(zhuǎn)化，通過gel filtration的方法，發(fā)現(xiàn)GHD7在體內(nèi)存在440-kDa左右的復(fù)合體形式。同時(shí)，Ghd7可以和HAP家族的多個(gè)亞家族成員發(fā)生蛋白互作，而和Ghd7互作的部分HAP成員又可以和生物鐘基因OsTOC1發(fā)生蛋白互作，說明這些HAP成員聯(lián)接了

8、外源信號(hào)和內(nèi)源生物鐘。最后我們發(fā)現(xiàn)HAP2亞家族和生物鐘基因的表達(dá)量均受到PHYB的調(diào)控。以上結(jié)果初步表明Ghd7、HAP家族和生物鐘三者之間可能通過蛋白互作的方式形成一個(gè)緩沖系統(tǒng)，調(diào)節(jié)水稻的魯棒性(robustness)。而PHYB則通過多種方式對(duì)其進(jìn)行調(diào)控，使得水稻能夠響應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境。
　　4.Ghd7參與激素調(diào)控
　　我們對(duì)Ghd7和激素的關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)分析:
　　1）超量表達(dá)Ghd7增加了內(nèi)源ABA的含量，

9、增強(qiáng)了植株對(duì)ABA的敏感性，同時(shí)延遲了種子的萌發(fā);
　　2）Ghd7改變了頂端生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸基因OsPIN1的表達(dá)，超量表達(dá)Ghd7抑制了內(nèi)源IAA的含量;
　　3）Ghd7特異在黃昏時(shí)分調(diào)節(jié)GA2ox基因的表達(dá)。而在超量表達(dá)Ghd7的背景下抑制內(nèi)源GA合成酶GA20ox1，植株仍然表現(xiàn)為半矮化表型，抽穗期也不再延遲，說明Ghd7對(duì)株高和抽穗期的調(diào)控需要GA。
　　以上結(jié)果說明Ghd7綜合參與多條激素途徑，其機(jī)制還有待