水稻氯離子通道蛋白基因OsCLC的克隆、表達(dá)和功能分析.pdf

1、在得到公認(rèn)的、7種植物所必需的微量元素中，Cl元素雖然是最晚被發(fā)現(xiàn)的，但對(duì)植物正常的生長和發(fā)育過程起著舉足輕重的作用。目前，氯離子通道(Chloride Charmel，CLC)一般被認(rèn)為與滲透調(diào)節(jié)、氣孔運(yùn)動(dòng)、營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、金屬耐性、信號(hào)識(shí)別與轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多功能有關(guān)。關(guān)于植物氯離子通道蛋白全序列克隆和功能的研究開展起步較哺乳動(dòng)物晚，而且多在擬南芥、煙草等雙子葉植物中進(jìn)行。水稻作為單子葉植物的代表植物和最重要的糧食經(jīng)濟(jì)作物之一，關(guān)于氯離子通道

2、的研究報(bào)道并不多見。 本研究在水稻全基因組測序基本完成的前提和基礎(chǔ)上，利用抑制消減雜交法(SSH)建立的水稻分化愈傷組織對(duì)愈傷組織的差減文庫，針對(duì)特異性表達(dá)的EST序列進(jìn)行分析和設(shè)計(jì)，首次從粳稻品種武進(jìn)9998-3中分離到一個(gè)氯離子通道蛋白編碼全長基因OsCLC，并對(duì)其表達(dá)譜和功能進(jìn)行了初步的研究，其主要結(jié)果如下： 1)以粳稻品種武進(jìn)9998-3為材料，擴(kuò)增出一個(gè)2429bp的全長cDNA序列 OsCLC(登錄號(hào)：DQ2

3、72692)。該序列具有完整的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，編碼808個(gè)氨基酸，結(jié)構(gòu)預(yù)測表明OsCLC具有11個(gè)疏水跨膜區(qū)、1個(gè)電壓門控的氯離子通道結(jié)構(gòu)(Voltage CLC)、1個(gè)胱硫醚β-合酶(Cystathionine-beta-synthase，CBS)結(jié)構(gòu)域和3個(gè)與陰離子選擇性有關(guān)的高度保守區(qū)(GSGIPE、GKAGPLVH和PVGGVLF)；與煙草CLC-Ntl、擬南芥AtCLC-a、AtCL

4、C-b、AtCLC-c、AtCLC-d和水稻日本晴OsCLC-1、OsCLC-2相似程度分別達(dá)到59％、54％、52％、58％、47％、63％和63％； 2)用乙酸鋰轉(zhuǎn)化法將OsCLC基因?qū)脶劸平湍竼我坏穆入x子通道基因ScCLC(Gefl)缺失的突變菌株中進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，可使其在添加有NaCl的培養(yǎng)基上生長功能得到部分恢復(fù)，且互補(bǔ)程度在高鹽濃度下更加明顯；同時(shí)在培養(yǎng)基中添加CaCl<,2>、KCl、MgCl<,2>(Cl<'

5、->濃度為500 mmol/L)的結(jié)果顯示：不同類型的陽離子對(duì)OsCLC的互補(bǔ)作用無影響；這些結(jié)果提示我們OsCLC基因可能在細(xì)胞內(nèi)起到平衡質(zhì)子電荷的作用。 3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)SYBR Green I熒光染料法檢測OsCLC基因表達(dá)譜分析表明： a)該基因在水稻的幼穗、旗葉、葉鞘、根、節(jié)、節(jié)間、葉、愈傷、芽點(diǎn)等組織中均有表達(dá)，根中的表達(dá)量最高；與日本晴的OsCLC-1表達(dá)情況類似，屬于非

6、組織特異性表達(dá)基因。 B)在0、50、100、200 mmol/LNaCl脅迫下，其表達(dá)量與鹽濃度、脅迫時(shí)間相關(guān)：鹽脅迫環(huán)境下生長1hr后，200 mmol/L NaCl脅迫下的表達(dá)量陡升至2.70倍，0、50、100 mmol/LNaCl基本無變化；8hr后50、100 mmol/L NaCl脅迫下的表達(dá)量分別達(dá)到2.74倍和3.16倍，同時(shí)200 mmol/LNaCl脅迫下的表達(dá)量卻已降低至1.52倍；16hr后各濃度脅迫下