表達牛輪狀病毒VP7蛋白重組干酪乳桿菌的構建及其免疫學初步分析.pdf

1、牛輪狀病毒(Bovine rotavirus)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus)。是引起犢牛非細菌性腹瀉的主要病原，牛輪狀病毒主要感染15~40日齡的犢牛，以厭食、嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡紊亂為特征性癥狀。如繼發(fā)牛冠狀病毒和細菌感染，則死亡率則高達80％，給養(yǎng)牛業(yè)造成很大經(jīng)濟損失。由于本病屬于糞口途徑傳播的腸道傳染性疾病。因此，設計疫苗以刺激腸道黏膜免疫，阻斷病原入侵的第一道防線，對科學防治本病具

2、有重要意義。
　　 本研究以干酪乳桿菌Lactobacillus casei 393作為遞呈抗原的活菌載體，利用牛輪狀病毒主要免疫保護性抗原基因VP7主要中和位點為靶基因，定向插入到干酪乳桿菌表面表達和分泌型表達載體pPG-1、pPG-2，構建了pPG-1-VP7/L.casei393和pPG-2-VP7/L.casei393重組乳酸桿菌系統(tǒng)。以此作為口服制劑，通過乳酸桿菌表達和傳遞外源抗原以及乳酸桿菌本身黏附定植作用，有效刺激

3、機體腸道黏膜免疫系統(tǒng)，達到預防牛輪狀病毒病目的。
　　 實驗從犢牛腹瀉糞便中擴增獲得了牛輪狀病毒VP7全基因，序列測定結果顯示，該病毒屬G6血清型，屬于牛輪狀病毒感染的廣泛流行株。實驗首先使用大腸桿菌表達系統(tǒng)摸索并驗證VP7基因在原核系統(tǒng)中表達的可能性及免疫效果。結果表明VP7蛋白第51~254位包含VP7蛋白主要抗原位點的基因片段得到了較好的表達。所制得的抗VP7蛋白小鼠抗血清具有較高的ELISA效價（1:6400）及中和抗體

4、（1:316）效價。在此基礎上，構建了表達牛輪狀病毒VP7重組干酪乳桿菌表面表達系統(tǒng)了pPG-1-VP7/L.casei393和分泌型表達系統(tǒng)pPG-2-VP7/L.casei393。經(jīng)乳糖誘導后，對菌體裂解物和培養(yǎng)上清進行的western blot檢測表明，pPG-1-VP7/L.casei393在菌體裂解物中檢測到了目的蛋白，而pPG-2-VP7/L.casei393表達系統(tǒng)在菌體裂解物和上清液中均檢測到了目的蛋白的存在；間接免疫熒

5、光試驗證明，表達的牛輪狀病毒VP7蛋白存在于菌體的表面。
　　 為進一步鑒定重組菌是否可誘導機體的系統(tǒng)和黏膜免疫應答，本實驗將小鼠共分為3組，每組10只?？诜庖呙恐皇?×109CFU活菌量，每隔14d免疫一次，免疫三次，每次連續(xù)免疫3d。免疫后于不同時間分別采集血清、糞便、外生殖道沖洗液樣品，通過間接ELISA測定糞便、外生殖道沖洗液樣品中特異性的sIgA和血清IgG水平，并通過細胞水平測定抗血清對病毒的中和效價，以評價其免疫

6、保護作用。
　　 間接ELISA檢測結果表明，口服免疫重組干酪乳桿菌后在小鼠糞便、外生殖道沖洗液均檢測到了特異性sIgA，在小鼠血清中檢測到了特異性的IgG。免疫重組菌后，小鼠外生殖道中sIgA于免疫后14d和37d、44d抗體水平達到峰值，和對照組相比，差異顯著（P＜0.05）；小鼠糞便中sIgA在23d和44d抗體水平達到峰值，和對照組相比，差異顯著（P＜0.05）；小鼠血清IgG水平在初次和再次免疫后未見抗體效價明顯升高，