牛消化道Ⅰ型肽載體(bPepTI)表達(dá)定量與真核表達(dá)技術(shù)研究.pdf

1、mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)定量技術(shù)和真核表達(dá)技術(shù)是研究牛小肽吸收營(yíng)養(yǎng)生理意義及bPepTI轉(zhuǎn)運(yùn)特性的必要技術(shù)手段。本研究采用Real TimePCR相對(duì)和絕對(duì)定量方法測(cè)定了牛消化道各段bPepTI基因mRNA的表達(dá)量；構(gòu)建了bPepTI蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)bPepTI蛋白，為建立牛消化道bPepTI蛋白表達(dá)的免疫熒光定量技術(shù)奠定了基礎(chǔ)；構(gòu)建了bPepTI基因的真核表達(dá)載體，為構(gòu)建bPepTI真核表達(dá)系統(tǒng)提供了前端關(guān)鍵技術(shù)。 1、牛消

2、化道各段I型肽載體(bPepTI)mRNA表達(dá)的定量研究 試驗(yàn)采用RT-PCR相對(duì)定量方法檢測(cè)利木贊×魯西黃牛雜交牛消化道各部位及渤海黑牛、荷斯坦牛、魯西黃牛和利木贊×魯西黃牛雜交牛四個(gè)不同品種牛小腸.PepTImRNA的表達(dá)差異。結(jié)果表明，牛各段消化道bPepTImRNA表達(dá)量由高到低的順序依次為空腸、回腸、盲腸、十二指腸、瘤胃、結(jié)腸、皺胃、瓣胃、網(wǎng)胃，消化道各段表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，消化道各段表達(dá)差異不顯著(P>0

3、.05)；不同品種牛小腸PepTImRNA的表達(dá)：十二指腸組織，四個(gè)品種之間差異極顯著(P<0.01)，荷斯坦牛表達(dá)量最高，顯著高于渤海黑牛(P<0.05)，極顯著高于魯西黃牛和利木贊×魯西黃牛雜交牛(P<0.01)，魯西黃牛與渤海黑牛、利木贊×魯西黃牛雜交牛差異不顯著(P>0.05)，渤海黑牛顯著高于利木贊×魯西黃牛雜交牛(P<0.05)；空腸組織，品種之間差異極顯著(P<0.01)，魯西黃牛表達(dá)量最高，與渤海黑牛、荷斯坦牛和利木贊×

4、魯西黃牛雜交牛差異顯著(P<0.05)，渤海黑牛和利木贊×魯西黃牛差異不顯著(P>0.05)，與荷斯坦牛差異顯著(P<0.05)；回腸組織，品種之間表量差異極顯著(P<0.01)，荷爾斯坦牛表達(dá)量最高，顯著高于渤海黑牛、魯西黃牛和利木贊×魯西黃牛雜交牛(P<0.05)，魯西黃牛和利木贊×魯西黃牛雜交牛差異不顯著(P>0.05)。 絕對(duì)定量法檢測(cè)利木贊×魯西黃牛雜交牛消化道各部位PepTImRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示，表達(dá)量由高到低依

5、次為：空腸、瓣胃、網(wǎng)胃、瘤胃、盲腸、十二指腸、回腸、皺胃、結(jié)腸，總體差異極顯著((P<0.01)。在胃部組織中，瓣胃bPepTI表達(dá)量最高，與網(wǎng)胃差異不顯著(P>0.05)，但極顯著高于瘤胃和皺胃(P<0.01)；網(wǎng)胃bPepTI的表達(dá)量與瘤胃和皺胃差異顯著(P<0.05)，瘤胃和皺胃之間差異不顯著(P>0.05)。腸道組織中，空腸bPepTI的表達(dá)量最高，極顯著高于十二指腸、回腸(P<0.01)；十二指腸與盲腸、回腸不差異顯著(P>0

6、.05)，十二指腸、回腸、盲腸顯極著高于結(jié)腸(P<0.01)?？漳cbPepTI的表達(dá)量顯著高于瓣胃(P<0.05)；瘤胃、十二指腸、回腸與盲腸之間差異不顯著(P>0.05)，十二指腸、回腸、盲腸與皺胃之間表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。結(jié)合本試驗(yàn)及其它試驗(yàn)研究結(jié)果，bPepTImRNA的表達(dá)量，空腸最高，其次是瓣胃，大腸表達(dá)量最低。 2、牛消化道I型肽載體(bPepTI)原核表達(dá) 為通過(guò)原核表達(dá)獲得純化bPepTI蛋白

7、，進(jìn)而能夠制備bPepTI蛋白抗體，建立消化道bPepTI蛋白表達(dá)量的熒光免疫定量方法，本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件克隆了bPepTI基因的完整編碼區(qū)，分別與pET-32α和pGEX-6P-J載體連接，構(gòu)建了原核表達(dá)載體并分析了bPepTI蛋白結(jié)構(gòu)。通過(guò)優(yōu)化IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、感受態(tài)細(xì)胞等條件進(jìn)行蛋白表達(dá)，在所優(yōu)化的表達(dá)條件下，重組體在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中未表達(dá)到理想蛋白，經(jīng)分析bPepTI含有8個(gè)糖基化位點(diǎn)，5個(gè)PKC和1