不同粗飼料對(duì)奶牛消化道小肽和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響研究.pdf

1、本研究的目的是檢測(cè)奶牛消化道上皮游離氨基酸(AA)和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的組織分布，探討粗飼料來(lái)源對(duì)這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響。18頭荷斯坦奶牛被隨機(jī)分到3組日糧中(n=6):AH:苜蓿干草為主要粗飼料;CS:玉米秸稈為主要粗飼料:RS:稻草為主要粗飼料。飼養(yǎng)試驗(yàn)后結(jié)束后，屠宰奶牛采取消化道內(nèi)容物及上皮組織（瘤胃、瓣胃、十二指腸、空腸和回腸），完成后續(xù)分析。獲得的主要試驗(yàn)結(jié)果如下。
　　1.不同部位消化道內(nèi)容物的游離氨基酸和肽結(jié)合氨基酸含量（

2、試驗(yàn)一）將瘤胃液、瓣胃食糜及小腸食糜取出，解凍后兩次離心取上清液，加入三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)。將處理好的澄清上清液直接用AA自動(dòng)分析儀測(cè)定游離AA濃度;以6 mol/L HCl水解后的總AA與游離AA含量之差作為肽結(jié)合氨基酸(PBAA)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在瘤胃中游離AA濃度為AH組和RS組高于CS組(P＜0.01)，而PBAA的濃度為AH組高于CS組，RS組和其它兩組差異不顯著(P=0.1)。在瓣胃、十二指腸和空腸食糜中，游離AA和PBAA濃度在

3、不同日糧下差異不顯著(P＞0.05)。PBAA和游離AA的比值在前胃和十二指腸相似（數(shù)值=1），而這一比率的數(shù)值在空腸小于1，這可能表明，PBAA在空腸得到充分的消化和分解，或者空腸對(duì)PBAA的吸收能力較強(qiáng)。
　　2.不同部位消化道組織的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體含量（試驗(yàn)二）
　　取出凍存的消化道組織，在液氮中研磨成粉狀后提取RNA和蛋白，用于后續(xù)的qRT-PCR和western blot，測(cè)定消化道上皮細(xì)胞的幾種重要AA轉(zhuǎn)運(yùn)載體(A

4、SCT2、CAT1、LAT1和ATB0,+) mRNA與蛋白的表達(dá)豐度，其中ASCT2和LAT1轉(zhuǎn)運(yùn)中性AA，ATB0，+轉(zhuǎn)運(yùn)中性和堿性AA，而CAT1轉(zhuǎn)運(yùn)堿性AA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，消化道不同部位ATB0,+、ASCT2、LAT1和CAT1都有表達(dá)，但不同部位表達(dá)量存在顯著差異(P＜0.05)。5種載體在空腸的表達(dá)量都高于其它幾個(gè)部位，表明空腸可能是奶牛蛋白質(zhì)消化吸收的主要部位。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)前胃也表達(dá)較高水平的AA轉(zhuǎn)運(yùn)載體，說(shuō)明前胃的吸收作用不能

5、忽視。三組日糧處理下AA轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)豐度有顯著差異:在瘤胃、瓣胃和十二指腸上皮，三組日糧處理下AA轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)豐度相似(P＞0.05);在空腸部位，CS組的ASCT2蛋白表達(dá)豐度高于AH組和RS組(P＜0.05);回腸部位的ATB0，+mRNA表達(dá)豐度在不同處理下差異顯著(P＜0.05)，AH組最高，CS最低。不同的粗飼料資源導(dǎo)致AA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)豐度發(fā)生變化，表明日糧對(duì)AA在消化道的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)有調(diào)控作用。
　　3.不同部位消化道

6、組織的肽結(jié)合氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體含量（試驗(yàn)三）
　　取出凍存的消化道組織，在液氮中研磨成粉狀，然后提取RNA和蛋白，用于后續(xù)的qRT-PCR和western blot。該試驗(yàn)的目的是檢測(cè)小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PEPT1)在奶牛消化道上皮的表達(dá)分布，評(píng)價(jià)不同粗飼料對(duì)PEPT1表達(dá)的影響作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，消化道5個(gè)部位皆表達(dá)PEPT1，但不同部位表達(dá)量存在顯著差異(P＜0.05):在空腸的mRNA表達(dá)量最高，在回腸的蛋白表達(dá)量最高，表明空腸和回腸是奶

7、牛小肽吸收能力最強(qiáng)的部位。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)前胃也表達(dá)較高水平的PEPT1表達(dá)。不同日糧處理下，PEPT1的表達(dá)差異顯著:在瘤胃中，RS組的PEPT1 mRNA表達(dá)量最高，AH和CS組差異不顯著(P＜0.05);在瓣胃，AH組PEPT1的mRNA表達(dá)豐度高于CS組(P＜0.05);在十二指腸，三組日糧處理下PEPT1的表達(dá)豐度相似(P＞0.05);在空腸部位，AH組的PEPT1蛋白表達(dá)豐度較低，但是CS組和RS組差異不顯著;回腸部位的PEPT1m

8、RNA表達(dá)豐度在不同處理下差異顯著(P＜0.05)，AH組最高，CS最低。不同的粗飼料資源導(dǎo)致小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)豐度發(fā)生類(lèi)似變化，表明小肽蛋白質(zhì)在消化道的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)受日糧營(yíng)養(yǎng)組分的調(diào)控。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)4種與AA轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體(CAT1、ATB0,+、ASCT2和LAT1)和PEPT1在奶牛胃腸道上皮細(xì)胞均有表達(dá)，且在奶牛胃腸道不同部位的表達(dá)量差異顯著，在空腸表達(dá)量最大，提示空腸是AA和小肽吸收能力最強(qiáng)的部位;不同粗飼料