PTEN、Akt和Trx真核表達載體的構建與Trx的表達檢測.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本文對PTEN、Akt和Trx的結構功能以及在胰島素分泌中的關系進行了闡述，構建了PTEN、Akt和Trx基因的相關質粒，檢測了Trx在細胞中mRNA水平的表達。這為研究ROS刺激下的胰島素分泌的分子機制提供了實驗材料和檢測方法。主要研究內(nèi)容如下：
　　 ⑴用RT-PCR法，從大鼠肝組織中提取總mRNA、合成cDNA并擴增Trx基因，定向克隆到表達質粒pcDNA3.0中，構建pcDNA3.0-Trx重組質粒，然后用PCR、酶切、

2、電泳和DNA測序鑒定，
　　 ⑵六孔板中，脂質體介導pcDNA3.0-Trx和pcDNA3.0轉染NIH 3T3成纖維細胞各兩孔，再用終濃度50 μΜ H2O2刺激未轉染任何質粒、轉染過pcDNA3.0和pcDNA3.0-Trx的各一孔，剩余一孔未轉染也未刺激的作為對照。用RT-PCR法，從上述NIH 3T3成纖維細胞中提取總mRNA并逆轉錄為cDNA，以較純的一樣品依次倍比稀釋10-1-10-5作為標準品，建立檢測18s mR

3、NA的標準曲線。
　　 ⑶實時熒光定量PCR儀上測出以上六種狀態(tài) Trx和18s的CT值，用2-△△ CT法分析Trx基因mRNA水平表達情況，測得終濃度50 μΜ H2O2刺激的細胞中Trx基因mRNA表達水平上確有提高。
　　 ⑷以pTRE-WT-PTEN、pTRE-G129R-PTEN、pTRE-G129E-PTEN質粒中相應PTEN為模板，用PCR技術得到野生型PTEN、G129R突變型PTEN、G129E突變型

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