HLA-B27拮抗肽真核表達載體的構建、表達及其生物學活性的初步研究.pdf

1、強直性脊柱炎(ankylosingspondylitis,AS)是一種嚴重危害人類身體健康和生存質量,并嚴重影響勞動力的慢性全身性自身免疫性疾病,其起病隱匿,病程長,最終導致患者喪失活動能力,甚至致殘。迄今AS的病因尚不不清楚,其發(fā)病機制并不明確,目前無任何特異性治療方法,因此有關AS治療策略的探索始終是國內外研究尤為關注的焦點、熱點和難點。目前所使用藥物與方案仍以非特異性緩解對癥療法為主,這會產生多種多樣的毒副作用。因此,如何研創(chuàng)出高

2、效、低毒、特異的新型藥物,使其既能迅速緩解AS的癥狀,又能地選擇性有效阻斷AS的病理過程已成為風濕免疫學領域亟待解決的關鍵問題!
　　從理論上講,任何能夠有效減少、抑制或阻斷AS病理生理發(fā)生與發(fā)展進程的藥物都能有效減輕或緩解AS的骨關節(jié)病變。鑒于HLA-B27是AS發(fā)生發(fā)展的免疫過程的中心環(huán)節(jié),選擇性阻斷HLA-B27信號途徑就成為有效治療AS自身免疫性疾病的重要策略之一。所以本課題擬將免疫阻斷與基因治療性疫苗兩大策略進行有機結合

3、,創(chuàng)新性研制出基于阻斷HLA-B27信號途徑的全新治療性基因疫苗。本研究在前期工作中采用HLA-B*2704及HLA-B*2705重鏈胞外區(qū)蛋白篩選噬菌體12肽隨機肽庫并獲得了能與其特異性結合的拮抗肽(antagonistpeptide,AP)。
　　本研究的主要目的是對篩選得到的AS治療性疫苗:HLA-B*2705-AP進行真核表達載體的構建、體外表達鑒定,并對其生物學活性進行初步研究。本研究首先對HLA-B*2705-AP進行

4、了pcDNA3.1真核表達載體的構建和表達鑒定,并對其生物學活性進行了初步研究。但是,由于HLA-B27拮抗肽分子量特別小,不利于體外實驗鑒定與觀察,所以本研究又進一步構建了融合有增強型綠色熒光蛋白編碼基因的pcDNA3.1/HLA-B*2704-AP-EGFP的融合表達載體和pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP的融合表達載體。通過系列研究獲得如下研究結果:
　　第一部分:pcDNA3.1/B*2705-AP真核

5、表達載體的構建、表達及其生物學活性的初步研究
　　1.通過PCR的方法得到了HLA-B*2705-AP基因,確定了所用的PCR條件為:98℃預變性5分鐘后;98℃變性10秒,60℃退火15秒,72℃延伸30秒,共30個循環(huán);循環(huán)結束后再72℃延伸8分鐘,最后于4℃保存。PCR得到目的基因為122bp。
　　2.得到的HLA-B*2705-AP基因通過T4連接酶連接到pMD18-T載體后在大腸桿菌Top10進行克隆,并且菌落P

6、CR和測序結果表明目的基因已經(jīng)連接到載體中。
　　3.得到的pMD18-T/HLA-B*2705-AP載體和pcDNA3.1(+)載體經(jīng)過KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切,構建pcDNA3.1(+)/HLA-B*2705-AP重組載體載體后在大腸桿菌Top10進行克隆,并且菌落PCR和測序結果表明目的基因已經(jīng)連接到載體中。
　　4.將重組表達載體pcDNA3.1(+)/HLA-B*2705-AP轉染cos7細胞,重組表達載體通過Ge

7、nFectin介導方法轉到真核細胞中,進行表達。通過RT-PCR的方法檢測轉染的真核細胞中B*2705拮抗肽-蛋白的表達,電泳結果表明轉染真核表達載體的細胞在100bp處可見特異性條帶,而未轉染的細胞沒有該條帶。
　　5.通過補體依賴性HLA-B27陽性淋巴細胞的細胞毒的試驗發(fā)現(xiàn),所轉染的真核細胞的上清可以有效阻斷特異性HLA-B27的殺傷作用。
　　第二部分:pcDNA3.1/B*2705/2704-AP-EGFP融合基因

8、真核表達載體的構建、表達及其生物學活性的
　　1.初步研究通過PCR的方法得到了HLA-B*2705-AP及HLA-B*2704-AP基因,確定了所用的PCR條件為:98℃預變性5分鐘后;98℃變性10秒,60℃退火15秒,72℃延伸30秒,共30個循環(huán);循環(huán)結束后再72℃延伸8分鐘,最后于4℃保存。PCR得到目的基因為122bp.。
　　2.得到的HLA-B*2705-AP及HLA-B*2704-AP基因片段和pcDNA3

9、.1(+)-EGFP載體經(jīng)過KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切,分別構建pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP以及pcDNA3.1/HLA-B*2704-AP-EGFP的融合表達載體,并在大腸桿菌Top10進行克隆,經(jīng)菌落PCR和測序結果表明目的基因已經(jīng)連接到載體中。
　　3.將重組表達載體pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP和pcDNA3.1/HLA-B*2704-AP-EGFP的融合表達載體分別轉染CH

10、O細胞,重組表達載體通過GenFectin介導方法轉到真核細胞中并進行表達。在熒光顯微鏡下可以清晰地看到在細胞中所表達的綠色熒光蛋白,經(jīng)流式結果表明熒光細胞占總細胞的比例分別是64.86％和57.91%,表明轉染效率較高。
　　4.通過RT-PCR的方法檢測轉染的真核細胞中B*2705-AP-EGFP及B*2704-AP-EGFP蛋白的表達,轉染真核表達載體的細胞在1000bp處可見特異性條帶(測序引物CMV-f和BGH-r),而

11、轉染空載體的細胞未出現(xiàn)此條帶,這說明該細胞已整合了該融合蛋白的mRNA。
　　5.采用WesternBlot方法檢測轉染后細胞表達融合蛋白的抗原性。結果表明轉染重組載體的細胞在相對分子質量約30KD處有陽性條帶,而空載體轉染細胞無任何條帶顯示。
　　6.在抗HLA-B27抗血清介導的補體依賴性HLA-B27陽性淋巴細胞的細胞毒的實驗中,100%的細胞死亡。若向此實驗體系中加入5μl轉染重組質粒B*2705-AP-EGFP及B

12、*2704-AP-EGFP的細胞破碎的上清,分別有50%和40%的細胞毒反應被阻斷,說明表達的重組蛋白有特異性阻斷B27反應的能力。
　　7.熒光顯微鏡分別檢測拮抗肽與細胞的結合情況,B*2705-AP-EGFP和B*2704-AP-EGFP與正常HLA-B27陰性B細胞不結合,而可分別與HLA-B*2705及B*2704陽性細胞株結合,表明這種結合具有特異性,同時用流式細胞術檢測的方法更進一步的證明了結合的特異性。
　　綜