NF2突變體真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、背景與目的： Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病（NF2）是一種高發(fā)的常染色體顯性遺傳性疾病，常發(fā)生多發(fā)性神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤和脊髓室管膜瘤等。NF2基因是一種腫瘤抑制基因（負(fù)生長調(diào)節(jié)基因），該基因的表達(dá)產(chǎn)物被命名為merlin。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)NF2基因突變及其表達(dá)產(chǎn)物merlin的功能異常是引起該病的基礎(chǔ)。NF2基因突變中的移碼突變(包括缺失、插入)、剪接位點(diǎn)突變及無義突變通過產(chǎn)生不穩(wěn)定的蛋白或不能形成分子內(nèi)復(fù)合體而破壞merlin的腫瘤

2、抑制作用。錯(cuò)義突變雖可產(chǎn)生穩(wěn)定蛋白，但其蛋白的功能目前知之甚少。為進(jìn)一步研究錯(cuò)義突變破壞merlin對(duì)細(xì)胞的生長抑制的機(jī)制，采用基因工程手段，進(jìn)行了突變型NF2 cDNA（亞型2）的構(gòu)建,將突變型NF2 cDNA克隆入真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，進(jìn)行了篩選和鑒定，并進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞HEK293，觀察轉(zhuǎn)染效果，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 通過定點(diǎn)突變產(chǎn)生1個(gè)含錯(cuò)義突變的NF2 cDNA：W41C，并電泳純化

3、回收后，和pEGFP-N1真核綠色熒光蛋白表達(dá)載體同時(shí)用EcoR I和BamH I雙酶切，再次電泳純化后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化細(xì)菌，篩選鑒定出陽性克隆，進(jìn)行DNA測序。將重組的pEGFP-N1-NF2-W41C提取純化后經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293中，用Western-Blotting方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的pEGFP-N1-NF2-W41C的merlin表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.通過使用重疊延伸法（SOE，sequence

4、 overlapped extension）定點(diǎn)突變產(chǎn)生1個(gè)含錯(cuò)義突變的NF2 cDNA：W41C。 2.突變靶基因與pEGFP-N1連接后，對(duì)轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，得到陽性克隆重組子pEGFP-N1-NF2-W41C。 3. DNA序列分析證實(shí)了重組載體pEGFP-N1-NF2-W41C內(nèi)插入片段的堿基組成與我們要定點(diǎn)突變的NF2 cDNA序列一致，證實(shí)陽性克隆插入片段為目的基因。 4.轉(zhuǎn)染了pEGFP-N

5、1-NF2-W41C和pEGFP-N1-NF2-WT的HEK293細(xì)胞可見綠色熒光，細(xì)胞核和胞膜均有熒光出現(xiàn)，說明轉(zhuǎn)染成功。還顯示兩者merlin均表達(dá)于胞漿內(nèi)，在細(xì)胞膜的附近有聚集。 5.轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-NF2-W41C和pEGFP-N1-NF2-WT的HEK293細(xì)胞中檢測到較高水平的merlin表達(dá)。 結(jié)論： 1.通過基因克隆和DNA測序，證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)中采用的定點(diǎn)突變技術(shù)成功的將NF2 cDNA（亞型