玉米幼胚再生體系及農(nóng)桿菌介導(dǎo)Chi-linker-Glu基因轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、玉米是重要的糧食作物和飼料作物，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的優(yōu)良玉米自交系的遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)玉米基因工程育種具有十分重要的意義。本研究以玉米骨干自交系幼胚為外植體建成了再生體系，并初步建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)Chi-linker-Glu基因的遺傳轉(zhuǎn)化體系，研究結(jié)果為今后玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因育種提供了一定的基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1．幼胚是目前遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最多的外植體。本研究以4個(gè)玉米骨干自交系為材料，通過(guò)正交試驗(yàn)和單因子試驗(yàn)優(yōu)化了玉米幼胚

2、再生的培養(yǎng)基，并對(duì)其多種影響因素進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在N685基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)初級(jí)愈傷組織時(shí)，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）起主導(dǎo)作用；誘導(dǎo)Ⅱ型愈傷組織時(shí)，脯氨酸（L-pro）、天冬酰胺（L-Asn）及2，4-D有顯著作用，L-pro作用更強(qiáng)些；而高濃度的水解酪蛋白（CH）有相反作用。繼代次數(shù)為1次和2次，其綠苗分化率較高。添加10g/L甘露醇有利降低褐化率。1/2 MS培養(yǎng)基附加0．2mg/L激動(dòng)素（KT）適合玉米分化苗生根。應(yīng)用

3、這個(gè)再生體系，4個(gè)自交系的幼胚均得到再生植株，頻率為55．2～18．3%。這個(gè)體系的建立，為進(jìn)一步建立以幼胚為受體系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化體系提供了平臺(tái)。 2．以87-1、137、綜3三個(gè)玉米骨干自交系的幼胚為材料，詳細(xì)研究了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)含有Chi-linker-Glu融合基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米的各種因素，建立了骨干自交系的遺傳轉(zhuǎn)化體系。研究結(jié)果表明：在感染液和共培養(yǎng)基中都加入乙酰丁香酮（150μmol/L），能顯著提高轉(zhuǎn)化效率；合

4、適的菌液濃度（OD600=0．6）、浸染時(shí)間（15 min）、共培養(yǎng)時(shí)間（60h）、較低共培養(yǎng)溫度（22℃）、較酸的共培養(yǎng)基（pH5．4）均有利于提高T-DNA轉(zhuǎn)移效率。感染前將Ⅱ型愈傷組織于附加60g/L甘露醇的培養(yǎng)基中高滲處理4h提高了轉(zhuǎn)化率；延遲篩選有利于提高抗性愈傷組織的存活率和分化率。應(yīng)用這個(gè)轉(zhuǎn)化體系，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。PCR檢測(cè)表明，外源基因已經(jīng)整合進(jìn)玉米基因組中。這一體系的建立，為進(jìn)一步將有用基因?qū)胗衩變?yōu)良自交系奠定了基