辣椒CaROP1結(jié)構(gòu)、功能及其分子機(jī)制研究.pdf

1、ROP是植物多功能的重要分子開(kāi)關(guān)，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和防御反應(yīng)等過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用，ROP的結(jié)構(gòu)和功能及其作用機(jī)制研究是闡明植物生長(zhǎng)發(fā)育和防御反應(yīng)復(fù)雜機(jī)制的有效途徑。但是迄今為止關(guān)于ROP家族的研究?jī)H限于擬南芥和水稻等少數(shù)植物或少數(shù)成員，人們對(duì)ROP調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程的認(rèn)識(shí)還相當(dāng)有限。
　　 本研究選擇作為典型的茄科植物且具有重要經(jīng)濟(jì)意義蔬菜的辣椒，在分離了辣椒CaROP1的全長(zhǎng)cDNA并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了較為詳細(xì)探討的基礎(chǔ)上，

2、獲得其DN-和CA-CaROP1突變體轉(zhuǎn)基因煙草T1代株系，分析DN和CA突變體對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉表皮細(xì)胞形態(tài)、根系生長(zhǎng)的影響，對(duì)外源激素處理的應(yīng)答及對(duì)逆境抗性及光合作用、光呼吸作用的影響，并利用酵母雙雜交技術(shù)分離了DN和CA-CaROP1突變體各自的互作蛋白，取得了以下研究結(jié)果：
　　 1、以擬南芥ROP10作為誘餌，blastn搜索辣椒EST庫(kù)，獲得與AtROP10同源的EST，對(duì)上述EST進(jìn)行拼接獲得一個(gè)共有序列并據(jù)此設(shè)計(jì)特異

3、性引物，采用PCR法篩選辣椒cDNA文庫(kù)，獲得一個(gè)cDNA陽(yáng)性克隆，測(cè)序并分析結(jié)果表明，該陽(yáng)性克隆長(zhǎng)度為1 149bp，含有一個(gè)編碼197個(gè)氨基酸殘基的開(kāi)放讀碼框，其推導(dǎo)的氨基酸序列與煙草、擬南芥、玉米等植物上篩選的ROP/Rac蛋白具有70[％]以上的同源性，且含有高度保守的ROP功能域,推測(cè)該陽(yáng)性克隆是辣椒ROP家族的成員之一，命名為CaROP1。
　　 2、構(gòu)建CaROP1與YFP的融合蛋白表達(dá)載體(p35S-ROP-YF

4、P)，采用基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布，發(fā)現(xiàn)CaROP1主要定位在細(xì)胞膜上。
　　 3、通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，在高溫、低溫、鹽脅迫和青枯菌等非生物和生物逆境脅迫下，CaROP1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生一定程度的改變。與無(wú)任何處理的對(duì)照相比，在高溫脅迫下，6h前表達(dá)比對(duì)照提高，但在6h后表達(dá)開(kāi)始降低；在低溫脅迫下表達(dá)略有升高；在NaCl脅迫下，除了部分時(shí)間點(diǎn)，CaROP1的表達(dá)有所降低；在

5、青枯病病原菌侵染作用下，CaROP1除在青枯菌接種24h外，其它時(shí)間點(diǎn)均比對(duì)照低。CaROP1在ABA、NAA、乙烯利、MeJA、SA等外源激素及外源活性氧H2O2的作用下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也不同程度地發(fā)生改變。在NAA作用下CaROP1在處理12h前下降，以后有所回升；ABA處理導(dǎo)致CaROP1表達(dá)量提高；乙烯利處理使CaROP1轉(zhuǎn)錄表達(dá)降低；在外源MeJA作用下CaROP1在2h前表達(dá)下降，以后高于對(duì)照；外源SA整體上使CaROP1的轉(zhuǎn)錄表

6、達(dá)升高。從熒光定量PCR的結(jié)果來(lái)看，CaROP1可能參與了生物逆境和非生物逆境的抗性調(diào)節(jié)，而且CaROP1參與調(diào)節(jié)的上述防御反應(yīng)可能與ABA、SA、JA、乙烯等信號(hào)途徑有關(guān)。
　　 4、通過(guò)構(gòu)建CaROP1的野生型、DN和CA突變體的雙子葉植物超表達(dá)載體，應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化煙草，獲得上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草植株及其相應(yīng)的T1代株系，應(yīng)用T1代株系的植株研究DN-和CA-CaROP1突變體對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的葉表皮細(xì)胞形態(tài)、失

7、水、根系生長(zhǎng)的影響，對(duì)外源激素ABA和NAA的應(yīng)答的調(diào)控，對(duì)植物的抗逆、光合作用及光呼吸速率的影響等。結(jié)果表明：
　　 (1)CaROP1對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的根系的側(cè)根生長(zhǎng)具有顯著的影響，側(cè)根數(shù)量依次為DN＞K326＞CA；
　　 (2)DN-CaROP1表達(dá)使葉片表皮細(xì)胞由野生型的不規(guī)則鑲嵌型變成長(zhǎng)條形，而CA-CaROP1表達(dá)則使煙草表皮細(xì)胞變成方形，而且經(jīng)膜定位突變的CA2S-CaROP1突變體的轉(zhuǎn)基因植株葉片表皮細(xì)胞形

8、狀接近K326，這說(shuō)明了膜定位對(duì)于CaROP1功能而言是必須的；
　　 (3)CA-CaROP1轉(zhuǎn)基因植株對(duì)外源ABA處理不敏感，而外源ABA處理可顯著抑制DN-CaROP1轉(zhuǎn)基因植株的根系生長(zhǎng)和種子萌發(fā)；對(duì)于外源NAA處理也表現(xiàn)出相似于ABA的結(jié)果，說(shuō)明CaROP1是ABA和生長(zhǎng)素信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子；
　　 (4)CA-CaROP1轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出對(duì)43℃高溫處理的敏感和對(duì)辣椒青枯病病原菌侵染的敏感，而DN-Ca

9、ROP1的轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)出對(duì)43℃高溫和辣椒青枯病侵染顯著高于野生型和CA-CaROP1轉(zhuǎn)基因植株的抗性；
　　 (5)CA-CaROP1和DN-CaROP1轉(zhuǎn)基因植株及野生型K326煙草植株葉片的光呼吸速率也存在顯著的差異，CA-CaROP1的轉(zhuǎn)基因植株葉片的凈光合速率略高于DN-CaROP1和K326植株，但DN-CaROP1轉(zhuǎn)基因煙草的光呼吸速率則顯著高于野生型K326煙草，CA-CaROP1的光呼吸速率最低。
　

10、　 5、通過(guò)酵母雙雜交分離獲得了DN-CaROP1和CA-CaROP1各自的部分互作蛋白。其中應(yīng)用CA-CaROP1為誘餌蛋白分離獲得了三類互作蛋白，一類促使ROP從CA形式轉(zhuǎn)變?yōu)镈N形式的ROPGAP蛋白、一類為含phox(PX)結(jié)構(gòu)域的推定蛋白，一類推定為P70蛋白的假定蛋白；應(yīng)用DN-CaROP1為誘餌蛋白分離獲得了一系列與DN形式ROP互作的蛋白，包括GEF和HPR蛋白等。其中ROPGEF是一類負(fù)責(zé)ROP從DN形式轉(zhuǎn)化為CA形

11、式的蛋白,長(zhǎng)度為1848bp,含有一個(gè) 533個(gè)氨基酸的開(kāi)放讀碼框(附錄2.1，圖27)且有一個(gè)DUF315的保守功能域(圖20)；HPR蛋白是一類與光呼吸有關(guān)的羥基丙酮酸還原酶，長(zhǎng)度為1486bp，含有一個(gè)486個(gè)氨基酸開(kāi)放讀碼框的蛋白(附錄2.1，圖26)，BLASTp功能域搜索與分析表明它與其它植物或單細(xì)胞生物衣藻的HPR具有較高的同源性,故將之命名為CaHPR1(圖19)。
　　 綜合分析上述結(jié)果，本研究獲得了一個(gè)位于細(xì)