RSL1D1在腫瘤細(xì)胞中的功能及其分子機(jī)制研究.pdf

1、RSL1D1(ribosomal L1-domain-containing1)，即細(xì)胞衰老抑制基因(CSIG，cellularsenescence-inhibited gene)，編碼一種核糖體蛋白，屬核糖體L1p/L10e家族。RSL1D1蛋白主要定位于核仁，在其N端和C端分別含有核糖體L1結(jié)構(gòu)域和賴氨酸富集區(qū)。研究表明，RSL1D1具有抑制細(xì)胞衰老、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的功能。最近，本課題組發(fā)現(xiàn)RSL1D1可能與p53之間存在相互

2、作用，推測RSL1D1可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本研究旨在闡明RSL1D1在腫瘤細(xì)胞中的功能及其與p53之間的相互作用，為最終解析RSL1D1與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系提供重要實驗依據(jù)。
　　首先，本項目研究了RSL1D1表達(dá)水平的下調(diào)對腫瘤細(xì)胞增殖速率的影響。利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒pLKO.1-shRNA，包裝用于敲低RSL1D1的慢病毒顆粒，感染人直結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，經(jīng)抗生素篩選，獲得敲低R

3、SL1D1的穩(wěn)定HCT116細(xì)胞株，并通過繪制生長曲線，分析RSL1D1的敲低對HCT116增殖速率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比較，RSL1D1被敲低后，HCT116的增殖速率明顯下降。
　　接著，利用流式細(xì)胞術(shù)分析了RSL1D1的表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞周期的影響。將上述制備的RSL1D1被敲低的HCT116細(xì)胞經(jīng)乙醇固定，利用PI染色法進(jìn)行染色，然后利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比較，RSL1D1的敲低導(dǎo)致Sub-G

4、1的明顯增加，表明RSL1D1的敲低促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示RSL1D1具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存的功能。
　　然后，研究了RSL1D1的表達(dá)下調(diào)與細(xì)胞凋亡信號途徑關(guān)鍵分子Bax和Puma表達(dá)水平之間的關(guān)系。收集上述制備的RSL1D1被敲低的HCT116細(xì)胞，利用實時熒光定量PCR和免疫印跡法檢測Bax和Puma的mRNA和蛋白質(zhì)水平。結(jié)果顯示，RSL1D1的表達(dá)下調(diào)后，作為p53下游靶基因的促凋亡因子Puma的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯升高，

5、而Bax的蛋白質(zhì)水平則沒有明顯變化，盡管其mRNA水平略有上升。本研究還發(fā)現(xiàn)RSL1D1的敲低導(dǎo)致p53負(fù)調(diào)控因子HDM2的蛋白質(zhì)水平明顯上升。提示RSL1D1可能通過抑制HDM2，從而調(diào)節(jié)p53的胞內(nèi)水平和活性，并進(jìn)一步通過抑制Puma促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。
　　最后，研究了RSL1D1與p53之間的相互作用。通過基因重組技術(shù)將編碼全長RSL1D1、RSL1D1(1-281)、RSL1D1(282-485)、RSL1D1(387-

6、490)的核苷酸序列克隆至原核表達(dá)載體pGEX-5X-1或pGEX-6P-1，同時將全長p53基因克隆至另一原核表達(dá)載體pET-32a。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并利用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠或鎳瓊脂糖凝膠純化融合蛋白，用于研究RSL1D1與p53之間的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RSL1D1能在體外與p53直接結(jié)合，并確定RSL1D1(387-490)參與結(jié)合p53。
　　綜上所述，本項目的一系列