HID-1在致密核心囊泡生成過程中的保守功能及其分子機制研究.pdf

1、肽類激素和神經(jīng)肽是生物體內(nèi)分泌調(diào)控和神經(jīng)信號傳遞過程中的重要信號物質(zhì)。在細(xì)胞內(nèi)，這些物質(zhì)都被包裝和儲存于一類特定的細(xì)胞器中，它們被稱為致密核心囊泡或分泌型囊泡。這些囊泡在反式高爾基體上產(chǎn)生，并通過高爾基體的分選過程最終發(fā)育成為成熟的致密核心囊泡。到目前為止，這一成熟過程中的分子機制還并不為人所清楚。我們的研究關(guān)注于一個從線蟲到哺乳動物都高度保守的定位于高爾基體的蛋白質(zhì)HID-1，它為我們揭開這一過程中未知的微觀分子機制提供了一個窗口。<

2、br>　　 Hid-1基因最早被發(fā)現(xiàn)于線蟲的高溫誘導(dǎo)休眠表型突變體篩選中。除了這一表型之外，hid-1突變體線蟲還有多種其他表型，例如較弱的運動失調(diào)表型和中度的排泄缺陷。這些暗示HID-1蛋白可能參與到囊泡胞吐調(diào)控環(huán)節(jié)。Hid-1基因編碼一個高度保守的推定的蛋白質(zhì)，在果蠅，小鼠和人中都只有一個同源蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析無法得到HID-1蛋白中的任何已知功能域。但是認(rèn)為該蛋白質(zhì)可能存在多次跨膜區(qū)。對這一蛋白質(zhì)的細(xì)胞生物學(xué)功能學(xué)術(shù)界還處于

3、未知狀態(tài)。
　　 鑒于hid-1基因的物種間的高度進化保守性，我們在線蟲和哺乳動物細(xì)胞中同時驗證了HID-1蛋白質(zhì)在致密核心囊泡成熟過程中的功能。我們的研究結(jié)果表明，HID-1的缺失不但減少了細(xì)胞內(nèi)可釋放的成熟致密核心囊泡的數(shù)量，還減少了致密核心囊泡所釋放的成熟的具有生物活性的小肽的量。在高爾基體上，我們通過融合熒光蛋白和免疫熒光實驗，證實HID-1具體定位與反式高爾基網(wǎng)至高爾基體中部。我們的密度梯度分離結(jié)果還表明HID-1參與

4、了膜蛋白分選到致密核心囊泡上的過程，電鏡實驗結(jié)果進一步證實HID-1因此能夠影響到致密核心囊泡的致密程度和功能。在缺乏HID-1的情況下，致密核心囊泡上特有的膜蛋白的量也出現(xiàn)下降，造成致密核心囊泡的錯誤定位和對他們內(nèi)部所要轉(zhuǎn)運的物質(zhì)的成熟化處理不足。這一部分的功能影響則通過在線蟲和哺乳動物細(xì)胞中的免疫熒光和生化分析得以證實。
　　 我們的實驗證實HID-1蛋白質(zhì)是協(xié)調(diào)膜蛋白分選到致密核心囊泡上的重要成分。這一發(fā)現(xiàn)將會極大地增進我

5、們對致密核心囊泡發(fā)生過程中長期困擾我們的分子機制問題的了解。為此，我們很清楚下一步我們必須要揭示HID-1蛋白質(zhì)所扮演的具體分子功能角色。而這一部分問題我們需要通過蛋白質(zhì)相互作用鑒定和結(jié)構(gòu)解析來進行分析。
　　 我們已經(jīng)對人源HID-1蛋白質(zhì)全長和片段進行了原核重組表達和純化，并得到了初步的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選結(jié)果，為下一步篩選到合適的蛋白質(zhì)晶體并通過X光衍射解析HID-1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)做好了鋪墊。我們也使用串聯(lián)親和純化技術(shù)對來自于構(gòu)