NUPR1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)、生物學(xué)功能及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是常見的腦原發(fā)性惡性腫瘤，具有發(fā)病率、病死率、復(fù)發(fā)率高及治愈率低的“三高一低”特點(diǎn)，即使采取膠質(zhì)瘤標(biāo)準(zhǔn)化治療方案—手術(shù)盡可能全切輔助放射治療（分割或/和標(biāo)準(zhǔn)腦部放療）和(或)替莫唑胺等藥物治療，中位生存時(shí)間仍不足15個(gè)月，對(duì)膠質(zhì)瘤尤其是高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者預(yù)后無(wú)明顯改善。隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)水平的發(fā)展，越來(lái)越多的能夠預(yù)測(cè)患者預(yù)后及治療反應(yīng)的分子標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)。
　　NUPR1(p8/ Com1)最早在研究胰

2、腺應(yīng)激性損傷機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，近來(lái),相關(guān)研究顯示在包括消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及血液系統(tǒng)等腫瘤組織中異常表達(dá),與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能調(diào)控相關(guān)。所以，本課題旨在探究 NUPR1在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)情況，與患者預(yù)后和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移、周期、凋亡及體內(nèi)成瘤有無(wú)相關(guān)性，及其相關(guān)的分子作用機(jī)制，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷和預(yù)后尋找出一新的分子標(biāo)記物，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因靶向治療提供一個(gè)新方向

3、和依據(jù)。
　　方法：
　　1. NUPR1在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)情況及與臨床病理因素的相關(guān)性：(1)收集大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科2004年7月-2009年7月收治并術(shù)后病理確診為膠質(zhì)瘤122例組織蠟塊標(biāo)本，并收集2013年-2016年收治的30例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和15例正常腦組織，液氮及-80°冰箱保存。根據(jù)WHO分級(jí)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行分級(jí)，整理臨床病理資料，對(duì)所有的患者進(jìn)行隨訪；（2）通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、Wester

4、n Blot等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)NUPR1在新鮮腫瘤組織和正常腦組織標(biāo)本中的表達(dá)差異；（3）通過(guò)免疫組織化學(xué)方法對(duì) NUPR1在腫瘤和正常腦組織中進(jìn)行定量和定位分子，并統(tǒng)計(jì)分析 NUPR1表達(dá)與臨床病理因素，同時(shí)進(jìn)行 COX單因素和多因素生存分析。2.體外實(shí)驗(yàn)中，NUPR1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的生物功能分析：（1）實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)細(xì)胞系中 NUPR1表達(dá)情況，選取U251和U87細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞U251和U87建立

5、NUPR1低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 shNUPR1，Western blot、實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。（2）通過(guò)細(xì)胞 MTT增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)、BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)shCtrl組細(xì)胞和敲低組shNUPR1細(xì)胞的增殖能力；（3）通過(guò)流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的變化，從而觀察NUPR1基因?qū)251和U87的細(xì)胞周期和凋亡的影響；（4）通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè) NUPR1基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 U251和 U87遷移情況的影響。3.

6、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，采用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)：（1）穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系建立成功后,裸鼠腋窩皮下種植對(duì)照組和敲低組細(xì)胞系，每日觀察并記錄腫瘤體積質(zhì)量變化，從而檢測(cè)細(xì)胞體內(nèi)成瘤情況及增殖能力；（2）免疫組化實(shí)驗(yàn)、蛋白印記實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)定量 PCR實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè) NUPR1在體內(nèi)腫瘤中的表達(dá)情況。4. NUPR1的作用機(jī)制研究：（1）通過(guò) Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè) shCtrl及 shNUPR1細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白表達(dá)情況；（2）通過(guò)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測(cè)shCtrl及

7、 shNUPR1細(xì)胞中影響增殖關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況，并采用Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，免疫雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NUPR1與差異蛋白的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1. NUPR1基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)高于正常腦組織
　　通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)收集的30例新鮮膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和15例正常腦組織中NUPR1表達(dá)情況，結(jié)果表明NUPR1基因mRNA水平在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)高于正常腦組織(P<0.05)。同樣，We

8、stern blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示6例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中NUPR1蛋白含量高于4例正常腦組織。免疫組化結(jié)果顯示在122例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，陽(yáng)性表達(dá) NUPR1基因的例數(shù)為74例，占樣本數(shù)的60.7%，低表達(dá)的例數(shù)為48例，占樣本數(shù)的39.3%(P=0.009)。
　　2. NUPR1基因表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別相關(guān)
　　通過(guò)免疫組化方法對(duì) NUPR1在腫瘤和正常腦組織中進(jìn)行定量和定位分析，并統(tǒng)計(jì)分析患者的性別、年齡、腫瘤位置、最大直

9、徑、切除情況及 WHO腫瘤分級(jí)與 NUPR1表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示 NUPR1基因定位于細(xì)胞核及胞漿中，年齡不小于50歲患者中，NUPR1陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為43例(69.4%)，小于50歲患者中 NUPR1陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為31例(51.7%)，P=0.063；女性患者中， 陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為29例(占59.2%)；男性患者中，陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為45例(占61.6%)，P=0.785；腫瘤最大直徑大于等于5cm患者中陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為33

10、例(占62.3%)，腫瘤最大直徑小于5cm患者中陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為41例(占59.4%)，P=0.750；腫瘤位于小腦的患者中陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為3例(33.3%)，位于額顳葉患者中陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為51例(62.2%)，位于頂枕葉患者中陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為11例(57.9%)，位于側(cè)腦室的患者中陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為9例(75.0%)，P=0.262；低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHO I/II）患者中陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為3例(17.6%)，高級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHO III

11、/IV）患者中陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為71例(67.6%)，P＜0.001。說(shuō)明 NUPR1蛋白的表達(dá)隨著 WHO的臨床病理級(jí)別的增髙而有升高趨勢(shì)，NUPR1在惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　3. NUPR1基因表達(dá)影響膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者預(yù)后
　　通過(guò)對(duì)患者的年齡、性別、腫瘤位置、最大直徑、切除情況、WHO腫瘤分級(jí)、術(shù)后 KPS評(píng)分，術(shù)后是否放化療及 NUPR1的表達(dá)情況進(jìn)行 Log-rank生存分析，發(fā)現(xiàn)年齡≥50歲、高級(jí)別膠

12、質(zhì)瘤、高表達(dá) NUPR1水平的患者中位生存時(shí)間顯著降低。COX單因素和多因素分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá) NUPR1的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相比于低表達(dá)患者的預(yù)后差（P＜0.024），從而證明 NUPR1能夠作為預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的分子標(biāo)記物。
　　4.穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系U251和U87的建立和鑒定
　　慢病毒構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)染U251和U87細(xì)胞，免疫熒光、實(shí)時(shí)定量PCR及免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)超過(guò)視野的80%以上，shNUPR

13、1組細(xì)胞的NUPR1 mRNA及蛋白表達(dá)水平分別比對(duì)照組 shCtrl細(xì)胞均顯著降低，從而證明了敲低 NUPR1基因水平的U251和 U87細(xì)胞模型建立成功。
　　5.低表達(dá)NUPR1抑制U251和U87細(xì)胞的遷移能力
　　通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)研究 NUPR1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組shCtrl細(xì)胞相比，敲低NUPR1基因表達(dá)水平明顯U251和U87抑制細(xì)胞的遷移速度和數(shù)量。
　　6.低表達(dá)NUPR

14、1抑制U251和U87細(xì)胞的增殖能力
　　體外實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞 MTT檢測(cè)結(jié)果表明：相比對(duì)照組 shCtrl，NUPR1敲減組 U251和 U87細(xì)胞增殖減緩（3-5天，P<0.001）；細(xì)胞熒光計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：NUPR1敲減組與 shCtrl組相比，細(xì)胞的存活率抑制明顯(P<0.001)；BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：相比對(duì)照組shCtrl，NUPR1敲減組U251和U87細(xì)胞增殖減緩(第4天，P<0.05)。體內(nèi)裸鼠成瘤試驗(yàn)中，與對(duì)

15、照組 shCtrl細(xì)胞相比，NUPR1敲減組U87細(xì)胞的裸鼠荷瘤體積顯著減小，減緩腫瘤的成瘤進(jìn)程，證明低表達(dá) NUPR1抑制細(xì)胞增殖。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明敲低 NUPR1基因表達(dá)明顯抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力。
　　7.低表達(dá)NUPR1介導(dǎo)P27阻滯細(xì)胞周期G0/G1期
　　流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組和敲低組 U251和 U87細(xì)胞周期分布，結(jié)果顯示與對(duì)照組 shCtrl相比，NUPR1敲低組 U251和 U87細(xì)胞周期 G0/G

16、1期(U251:平均48.36%vs.39.74%，U87:平均46.75%vs.36.63%，P<0.001)，而S和G2期細(xì)胞比例分別為U251:36.65%vs.40.59%和15.41%vs.19.67%;U87:37.8%vs.41.79%和20.67% vs.21.58%（P<0.05），證明低表達(dá) NUPR1阻滯細(xì)胞周期G0/G1期。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞中的周期相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：相比于shCt

17、rl組細(xì)胞，shNUPR1組細(xì)胞中P27高表達(dá)，而CDK2、CyclinE表達(dá)下降。免疫組化檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中P27、CDK2及CyclinE表達(dá)情況，結(jié)果顯示隨著膠質(zhì)瘤 WHO級(jí)別的升高，P27表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，CDK2及 CyclinE高表達(dá)趨勢(shì)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織 P27低表達(dá)。裸鼠荷瘤組織的免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 shNUPR1組細(xì)胞中 P27高表達(dá)。從而證明，NUPR1介導(dǎo) P27阻滯細(xì)胞周期G0/G1期。
　　8.低表達(dá)NU

18、PR1促進(jìn)U251和U87細(xì)胞凋亡
　　流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組和敲低組 U251和 U87細(xì)胞凋亡數(shù)，shCtrl組U251細(xì)胞凋亡比例3.08%，shNUPR1組U251細(xì)胞凋亡比例12.0%(U87:6.05%vs2.34%)，結(jié)果證明低表達(dá)NUPR1促進(jìn)U251和U87細(xì)胞凋亡。
　　9. NUPR1通過(guò)ERK、P38MAPK信號(hào)通路影響U251和U87細(xì)胞增殖
　　蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測(cè) shCtrl及 shNUP

19、R1細(xì)胞中影響增殖關(guān)鍵蛋白，Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示低表達(dá) NUPR1組細(xì)胞中 p-ERK(ERK1/2，Thr202/Try204)、p-P38(Thr180/Try182)呈現(xiàn)低表達(dá)水平，而 p53、總 ERK1/2、P38表達(dá)量無(wú)變化。對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和正常腦組織進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示 NUPR1分別與 p-ERK、p-P38共表達(dá)。說(shuō)明干擾 NUPR1基因后對(duì)U251和U87細(xì)胞產(chǎn)生的抑制功能很可

20、能是通過(guò)抑制 ERK和 P38的磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　　1.NUPR1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中高表達(dá),其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)及預(yù)后顯著相關(guān)；
　　2.干擾NUPR1基因影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、遷移能力；
　　3.干擾NUPR1基因降低裸鼠體內(nèi)荷瘤的增殖能力；
　　4.干擾 NUPR1基因通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期抑制蛋白 p27抑制細(xì)胞周期 G0/G1期，進(jìn)而抑制膠母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞的遷移能力；