藍(lán)藻NDH-CET的生理功能及其分子調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、NADPH脫氫酶（NDH-1）介導(dǎo)的圍繞光系統(tǒng)I的循環(huán)電子傳遞（NDH-CET）在藍(lán)藻循環(huán)電子途徑中扮演著極其重要的角色。通常，在高光等脅迫條件下，NDH-CET能夠大大增加和產(chǎn)生額外ATP，從而增強(qiáng)了藍(lán)藻細(xì)胞應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境的能力。然而，人們至今對(duì)藍(lán)藻細(xì)胞在脅迫條件下如何調(diào)控NDH-CET活性的分子調(diào)控機(jī)制和抵御多種環(huán)境脅迫（例如高溫）的實(shí)例尚了解不夠。
　　一方面，為了找到NDH-CET調(diào)控相關(guān)的蛋白，在高光條件下，對(duì)集胞藻680

2、3轉(zhuǎn)座子插入突變體庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得兩個(gè)高光下生長(zhǎng)較快且NDH-CET活性增強(qiáng)的突變體。經(jīng)鑒定在這兩個(gè)突變體中轉(zhuǎn)座子插入同一個(gè)基因--ssl1690；該基因編碼NDH-1復(fù)合體NdhO亞基。以上結(jié)果暗示著在藍(lán)藻細(xì)胞中NdhO可能抑制NDH-CET活性。隨后分別構(gòu)建獲得了ndhO基因的突變株ΔndhO和過表達(dá)株OX-ndhO，并分析了兩個(gè)株系中NDH-CET活性變化。結(jié)果表明ndhO基因的缺失提高了NDH-CET的活性，相反過表達(dá)ndhO基

3、因削弱了NDH-CET的活性，證明在藍(lán)藻細(xì)胞中NdhO抑制NDH-CET活性。進(jìn)一步，ndhO基因的缺失或過表達(dá)并不影響Ndh亞基的表達(dá)。然而，ndhO基因的缺失增加類囊體膜上NDH-1中復(fù)合體（NDH-1M）的積累；相反，過表達(dá)ndhO基因降低了NDH-1M上的積累。以上結(jié)果表明NdhO通過降低NDH-1M的穩(wěn)定性，抑制NDH-CET活性。
　　利用酵母雙雜交篩選NdhO與構(gòu)成NDH-1M的14個(gè)亞基之間的相互作用，結(jié)果表明Nd

4、hO僅與NdhI和NdhK兩個(gè)亞基之間存在較強(qiáng)的相互作用；并且NdhI與NdhK之間也存在相互作用。而且，隨著加入NdhO的不斷增加，NdhI與NdhK之間的相互作用逐漸減弱。因此，NdhO位于NdhI與NdhK之間并阻礙了兩者之間的相互作用，導(dǎo)致NDH-1M的穩(wěn)定性降低，從而抑制NDH-CET的活性。
　　將WT從生長(zhǎng)光轉(zhuǎn)移到高光的過程中，細(xì)胞內(nèi)NdhI和NdhK的表達(dá)顯著上調(diào)，而NdhO的表達(dá)不變。在高光脅迫下，NdhO相對(duì)化

5、學(xué)計(jì)量的降低減少了對(duì)NdhI與NdhK之間相互作用的阻礙，提高了NDH-1M的穩(wěn)定性及NDH-CET的活性。這表明在高光下，藍(lán)藻細(xì)胞通過NdhO負(fù)調(diào)控NDH-CET的機(jī)制提高NDH-CET活性，從而有效抵抗高光脅迫。
　　另一方面，為了揭示藍(lán)藻NDH-CET在高溫脅迫下的生理功能，我們利用集胞藻6803的NDH-CET削弱突變體ΔndhS展開了以下實(shí)驗(yàn)。在高溫脅迫下，ΔndhS表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢的表型。通過葉綠素?zé)晒夥治霭l(fā)現(xiàn)，隨著熱脅

6、迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，WT的NDH-CET活性受到高溫誘導(dǎo)逐漸增加；但高溫誘導(dǎo)后，ΔndhS的NDH-CET活性未增加。這說(shuō)明NDH-CET對(duì)熱脅迫有響應(yīng)，參與熱脅迫下的光保護(hù)。
　　利用藍(lán)綠溫和凝膠電泳和蛋白免疫印跡方法對(duì)WT和ΔndhS類囊體膜上主要光合復(fù)合體的積累進(jìn)行分析，與WT相比，高溫處理導(dǎo)致ΔndhS中光合復(fù)合體均有所減少，光系統(tǒng)II（PSII）的減少尤為明顯；而正常生長(zhǎng)溫度下，ΔndhS和WT中光合復(fù)合體的積累無(wú)差異。同

7、樣地，正常生長(zhǎng)溫度下，ΔndhS和WT中PSII和PSI的活性類似；而熱脅迫處理后，與WT相比，ΔndhS的PSII和PSI的活性均降低，PSII活性的降低更加明顯。以上結(jié)果表明熱脅迫下NDH-CET的缺失主要導(dǎo)致PSII受到損傷和活性降低。
　　高溫脅迫下，與WT相比，ΔndhS的 FV/FM活性顯著降低；而加入抑制PSII修復(fù)的蛋白合成抑制劑林肯霉素后，WT和ΔndhS的FV/FM活性降低程度相似。這說(shuō)明NDH-CET的缺失影

8、響PSII的修復(fù)過程。熱脅迫后，ΔndhS中D1蛋白的表達(dá)明顯低于WT中D1蛋白的表達(dá)；加入林肯霉素后，WT與ΔndhS中均基本檢測(cè)不到D1蛋白。以上結(jié)果進(jìn)一步肯定了熱脅迫下NDH-CET的缺失影響了PSII的修復(fù)，從而加劇了PSII的損傷。高溫脅迫下NDH-CET可能通過產(chǎn)生跨膜質(zhì)子梯度及額外ATP，參與修復(fù)損傷的PSII和保護(hù)PSII活性。
　　綜上所述，我們鑒定到了一個(gè)負(fù)調(diào)控NDH-CET的蛋白NdhO，并揭示了NdhO作用